AIを活用した分析がいかに創薬を加速させるか

歪みを持つスピロ複素環は、創薬における価値ある三次元バイオアイソスターとして認識が高まっています。これらの剛直な三次元分子フレームワークは、従来の平面的な芳香族化合物と比較して複雑な生物学的結合部位をより適切に補完できる骨格を提供し、製薬業界に「フラットランドからの脱却」をもたらす可能性を秘めています。スピロ[3.3]ヘプタンについてはその有益な特性が広く実証されていますが、その下位同族体であるスピロ[2.3]ヘキサン（共有するスピロ炭素を介して3員環と4員環が縮合した歪みを持つサブセット）は、合成の難しさと生物学的データの不足により、ほとんど未開拓のままです。

これは見過ごされてきた機会です。なぜなら、これらの歪みを持つスピロ系は、その剛直な幾何学的構造に加え、標的選択性の向上、溶解性の改善、代謝安定性の向上、そしてオフターゲット効果の低減をもたらす可能性があるからです。さらに、これらはこれまでアクセスできなかった化学空間において、新たな知的財産上の優位性も提供します。

研究者はどのようにしてこれらのモチーフにアクセスし、標的とリガンドの相互作用を理解し、どの3D候補が創薬開発において最も有望かを予測できるのでしょうか。この問いに答えるため、イタリアのバーリ大学（アルド・モーロ大学）のレンツォ・ルイーシ教授率いる研究チームは、9種類のスピロ[2.3]ヘキサン誘導体に対する新しい合成アプローチを開発し、CAS BioFinder®で利用可能な新しいAI主導の予測分析を用いて、生物活性化合物としての可能性を評価しました。このプロジェクトは、欧州委員会のホライズン・ヨーロッパ・フレームワーク「Project SusPharma」（助成金契約番号101057430）の支援を受けています。本研究の全成果は、最近Angewandte Chemie International Editionの研究論文として発表されました。

この手法は、文献に基づいたリガンドと標的の相互作用および薬理学的ポテンシャルの迅速なインシリコ評価を可能にすることで、この分野の研究を加速させる実用的な方法であり、未開拓の化学領域から治療に関連する新しいクラスの分子を発見する一助となります。

スピロ[2.3]ヘキサンの利点と合成上の課題

「フラットランドからの脱却」および「コンフォメーション制限」という概念は、創薬候補化合物におけるsp³混成炭素中心の割合を高めることが、発見から臨床承認に至るまでの成功率向上に関連していることを示しています。歪みを持つsp³リッチなスピロ環状骨格はこれらの基準を満たしており、創薬における価値ある構造モチーフとして、メディシナルケミストから注目を集めています。

これまでメディシナルケミストは、2つのスピロ縮合した4員環を持つヘテロ原子含有スピロ[3.3]ヘプタンに多大な注意を払い、ピペラジンやモルホリンといった従来の歪みのない複素環のバイオアイソスター代替物として研究してきました。これらの研究により、このような歪みを持つsp³リッチなモチーフを組み込むことで、臨床試験に進むような優れた物理化学的特性を持つ化合物を創出できることが示されています。

An analysis of publication data in CAS SciFinder® reveals the utility of the spiro[3.3]heptanes due to the presence of substantial number of reported synthetic derivatives and the large volume of patent applications and academic publications centered on this scaffold (see Figure 1). Although the lower homologue spiro[2.3]hexanes have attracted increasing academic attention over the past five years, demonstrated by a rising number of related publications shown in Figure 2, a systematic investigation of their bioisosteric potential remains elusive. This is despite their comparable physicochemical properties and reported biological activities, including inhibition of HDAC1/3 and HIPT1.  

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表1に示す包括的なCAS SciFinderデータは、文献で報告されている9種類の異なるスピロ[2.3]ヘキサン構造モチーフの普及状況を示しています。注目すべきは、スピロ[2.3]ヘキサンのほとんどの複素環誘導体は未開発のままであり、学術的な報告は限られ、特許出願もほとんど、あるいは全く確認されていないという点です。

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こうしたモチーフを効率的に組み込む上での合成上の課題に加え、化学反応性や安定性に関するデータが不足していることが、創薬における広範な利用を妨げてきたと考えられます。

スピロ[2.3]ヘキサンの従来の合成法では、エポキシ化、アジリジン化、またはシクロプロパン化を介して、あらかじめ構築された4員環骨格に3員環を導入するのが一般的です[スキーム1A (i)を参照]。しかし、これらの手法は過酷な条件を必要とすることが多く、許容される官能基が限られている上に、3員環上の置換基の構造を変更するたびに前駆体を再合成する必要があるため、モジュール性に欠けています。

最近では、ビシクロ[1.1.0]ブタンの分子内歪み解放反応に基づく、より柔軟な戦略が登場しており、スピロ[2.3]ヘキサン骨格へのモジュール的なアクセスが可能になっています[スキーム1A (ii)を参照]。とはいえ、このアプローチも依然として反応性の高い中間体に依存しており、シクロプロパンやオキセタン由来のスピロ誘導体の調製には対応していません。

前述の欠点を克服し、ヘテロ原子を含むスピロ[2.3]ヘキサンライブラリーへの迅速なアクセスを実現するため、研究チームは4員環を有する新規スルホニウム塩を設計しました。これは、ジョンソン・コーリー・チャイコフスキー型反応を介して、穏和な条件下で様々なπ親電子試薬（アルケン、カルボニル、イミン）に転移させることができ、スキーム1Bに示すように、9種類の異なるスピロ[2.3]ヘキサンモチーフをモジュール方式で構築可能です。

A)

B)

スキーム1。 A) スピロ[2.3]ヘキサン合成の最先端アプローチ。 B) 4員環含有スルホニウム塩を主要な前駆体として用いた、スピロ[2.3]ヘキサン骨格およびそのヘテロ原子含有誘導体の構築に向けた合成計画。
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スピロ[2.3]ヘキサンの合成

スキーム1Bに示す設計計画を実現するため、4員環（シクロブタン、オキセタン、アゼチジン）を有する3種類の新規スルホニウム系試薬1-3を開発しました。4員環を有するアリールスルフィドが重要な中間体であることが判明し、これをスルホキシドに酸化した後、1,3,5-トリメトキシベンゼンおよび無水トリフルオロメタンスルホン酸との反応によりスルホニウム塩へと変換しました。この経路はマルチグラムスケールまで拡張可能であり、得られた試薬は安定した流動性のある固体であるため、実験室での取り扱いが容易であり、本アプローチに重要な実用性をもたらしています。調製の詳細については、原著論文をご参照ください。

目的とするジョンソン・コーリー・チャイコフスキー反応の最適化を経て、9種類すべてのスピロ[2.3]ヘキサンコアを網羅する60以上の基質にアクセスすることで、本合成戦略の実用性とモジュール性を実証し、あらかじめ設定したすべての目標を達成しました。代表的な例をスキーム2に示します。例えば、スチレン、ビニルスルホキシド、アクリレート、アクリルアミドなど、様々な電子不足アルケンとの反応により、目的のスピロ[2.3]ヘキサンが得られ、レフルノミド誘導体のような医薬品関連コアの組み込みが可能になります。電子豊富なアルケンと電子不足アルケンに対するスルホニウム塩の反応性の違いは、本反応がカルベン挿入ではなく、イリドによる親核攻撃を経て進行することを示唆しています。対応するエポキシド誘導体はケトンやアルデヒドとの反応で得られ、これは医薬品有効成分であるフェノフィブラートの組み込みにも適用可能でした。最後に、アジリジン含有誘導体は、スルホニウム塩1-3とイミンの反応により得ることができます。本戦略は、イミン窒素の容易な官能基化により、複雑なイミンへのスピロ[2.3]ヘキサンモチーフの導入も可能にしました。これに基づき、セレコキシブコアのみを組み込んだスピロアジリジン、およびセレコキシブとフェノフィブラートの両方のコアを持つスピロアジリジンの合成に成功し、本手法がスピロ[2.3]ヘキサンモチーフを特徴とする創薬候補分子を提供できる能力があることを実証しました（スキーム2を参照）。注目すべきは、4員環の性質にかかわらず反応が良好に進行し、ヘテロ原子を含むスピロ[2.3]ヘキサン誘導体へのアクセスが可能になった点です。

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スピロ[2.3]ヘキサン誘導体のバイオアイソスター（生物学的等価体）としての可能性の体系的評価

9種類すべてのスピロ[2.3]ヘキサン誘導体が利用可能になったことで、スピロ[3.3]ヘプタンと同様に、そのバイオアイソスターとしての可能性を体系的に調査できるようになりました。これまで、これらの構造モチーフに関する徹底的かつ体系的な特性評価は行われてきませんでした。

この評価を行うため、スキーム3に示す3段階のワークフローを用いたバイオアイソスター同定戦略を開発しました。

ステップ1。共通の物理化学的特性を持つ複素環を同定するためのクラスタリングベースのアプローチ：

まず、教師なし学習アプローチを用いて、得られた9種類の（ヘテロ原子含有）スピロ[2.3]ヘキサンコアすべてを、創薬で一般的に使用される70以上の複素環からなる仮想データベースと比較し、スピロ[2.3]ヘキサンと医薬品化学で汎用される複素環との間の潜在的なバイオアイソステリズムを特定しました。

そのため、すべての構造に対してDFT最適化（ωB97XD3BJ/631++G(d,p)）を行い、エネルギー的に最小化された三次元コンフォメーションとその関連特性を取得しました。一次元（分子量、ヘテロ原子数）、二次元（創薬適性、logP、トポロジカル極性表面積）、および三次元（双極子モーメント、最良適合面、非球状性）の分子記述子を選択し、RDKitを用いて計算することで、物理化学的特性の比較と創薬適性の評価を可能にしました。

堅牢な統計解析を確実にするため、記述子を精査し、log₁₀(VIF) ≥ 5のものを除外しました。主成分分析（PCA）とk-メドイドクラスタリングによる次元削減により、高次元データセットの可視化を実現しました。PCAは化学空間の次元を削減し、記述子の寄与を評価する一方、k-メドイドクラスタリングはシルエットスコア解析に基づいて5つの明確なクラスター（k = 5）を特定しました。

9種類のスピロ[2.3]ヘキサン誘導体のうち8種類は、医薬品関連の複素環であるイソキサゾール（レフルノミドに含まれる）およびピリジンとともにクラスター化されました。異なるクラスターではあるものの、ピペリジンはスピロ[2.3]ヘキサンコアと空間的に近い位置にありました。3D PCA空間において、ピペリジンと5-アザスピロ[2.3]ヘキサンのクラスター内平均距離はそれぞれ3.20 ± 0.76および2.28 ± 1.11であり、クラスター間距離はわずか1.69であり、物理化学的類似性が確認されました。同様に、スピロ[2.3]ヘキサンは3.59 ± 1.18の平均クラスター内距離を示し、ピペリジンとの距離は3.18でした。ピペリジンと比較して、スピロ[2.3]ヘキサン、5-アザスピロ[2.3]ヘキサン、および5-オキサスピロ[2.3]ヘキサンは、同様の分子体積（結合部位の適合性に不可欠）と優れた3D創薬適性指標（PBF）を示しました。注目すべきは、5-アザスピロ[2.3]ヘキサンが同等の双極子モーメントを示しつつも、歪みエネルギーが増加した点です。クラスタリングの近接性と分子記述子の類似性は、5-アザスピロ[2.3]ヘキサンが有望な歪み型ピペリジンバイオアイソスターであることを裏付けています（表2を参照）。

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ステップ2：AI駆動型の標的・リガンド相互作用予測による、特定の生物学的標的に対する候補選定の精緻化：

インシリコでin-silicoピペリジンとの潜在的な類似性を確立した後、この仮説を実例で検証しました。ピペリジン骨格を持つμオピオイド受容体アゴニストであるペチジンを、現在の手法との構造的適合性および（毒性のあるノルペチジン代謝物の生成を考慮した）より安全な代替薬への臨床的ニーズから、試験対象として選定しました（図3aを参照）。μオピオイド受容体に対して活性を示す可能性が最も高いアナログを特定し、インビトロ試験の候補を優先順位付けするために、AIを活用した予測分析を採用しました。この目的のためにCAS BioFinderを選定しました。このプラットフォームにより、科学文献から抽出された精選された化学・生物学的関係を用いてタンパク質とリガンドの相互作用をモデル化し、薬理活性の迅速かつデータ駆動型のインシリコ予測が可能となりました。5-アザスピロ[2.3]ヘキサン骨格を持つペチジンアナログをヒトμオピオイド受容体に対して評価するため、反復的な予測分析ワークフローを適用しました（図3bを参照）。in vitro試験の候補を優先順位付けするために、AIを活用した予測分析を採用しました。この目的のためにCAS BioFinderを選定しました。このプラットフォームにより、科学文献から抽出された精選された化学・生物学的関係を用いてタンパク質とリガンドの相互作用をモデル化し、薬理活性の迅速かつデータ駆動型のin-silico予測が可能となりました。5-アザスピロ[2.3]ヘキサン骨格を持つペチジンアナログをヒトμオピオイド受容体に対して評価するため、反復的な予測分析ワークフローを適用しました（図3bを参照）。

初期スクリーニング（pActおよび信頼度スコア；表3）により、アナログ4および5が有望であると特定され、予測pAct値はそれぞれ6.54および5.92でした。クラスタリングによって有望性が低いと判断されたスピロ[2.3]ヘキサンおよび5-オキサスピロ[2.3]ヘキサンアナログ（6および7）には、予測される活性は見られませんでした。これらの結果に基づき、エステル側鎖を修飾することで、さらなる5-アザスピロ[2.3]ヘキサン誘導体を探索しました。エチルエステルをメチル（8）またはイソプロピル（9）基に置換しても、予測pAct値はわずかに低下するのみでした（6.50および6.48）。興味深いことに、アゼチジンエステル（ (10）を導入すると予測活性が大幅に向上しました（pAct 7.22）。一方、オキセタンエステル（ (11）は、評価対象の標的に対して予測される活性を示しませんでした。

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ステップ3：In vitro選択した標的との高い相互作用確率を示す優先リガンドのインビトロ検証：

予測分析アプローチを実験的に評価するため、μオピオイド受容体に対して最も高い予測活性（pAct）を示した3つのリガンド（化合物4、8、および10）を、陰性対照としてのスピロ[2.3]ヘキサンin vitro66とともにインビトロ試験用に選定しました。これらの化合物はすべて開発した手法を用いて合成し、μオピオイド受容体を発現するSH-SY5Y神経芽腫細胞を用いたラベルフリー結合アッセイ（PerkinElmer社製EnSpireプラットフォーム）により評価しました。屈折率の変化を検出する光学バイオセンサーを用いて段階希釈（0.03～150 μM）を分析し、既知のμオピオイド受容体アゴニストであるDAMGOを陽性対照として使用しました。

用量反応解析の結果、試験したすべての化合物でマイクロモル濃度の結合活性（10～39 μM）が明らかになり、μオピオイド受容体への関与が確認されました（図4を参照）。予測された活性化合物（4、8、および10）で観察された結合は、インシリコ予測と一致しており、5-アザスピロ[2.3]ヘキサン骨格が置換ピペリジンのバイオアイソスターとして適していることを裏付けています。CAS BioFinderで最も高いpActが予測されたアナログin silico1010が、最も優れた結合活性（10 μM）を示しました。

教師なし学習により、一般的に適したバイオアイソスター骨格の特定が可能となりましたが、AI駆動型の標的予測は、実験的検証に向けた候補の優先順位付けに効果的でした。注目すべきは、クラスタリング分析においてピペリジンと構造的に近接しているにもかかわらず不活性と予測された化合物6も、測定可能な結合活性を示した点です。これは、利用可能な学習データにおいて表現が限られている骨格に予測モデルを適用する場合の現在の限界を浮き彫りにしています。

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創薬におけるバイオアイソスター特定のための新しいアプローチ

3種類の新規スルホニウム塩試薬を用いて、これまで十分に探索されていなかったスピロ[2.3]ヘキサンアナログにアクセスするための、簡便かつ汎用的で官能基許容性の高い戦略を開発しました。この合成プラットフォームは幅広い適用が可能であり、電子不足アルケン、カルボニル化合物（ケトンおよびアルデヒド）、イミンが、それぞれスピロ環状シクロプロパン、エポキシド、アジリジンを形成するための有効な反応パートナーとして機能することが示されました。合計60例以上が報告されており、この手法の汎用性と堅牢性が強調されています。

合成開発に加え、スピロ[2.3]ヘキサンのバイオアイソスターとしての可能性を、教師なし学習とAI強化型予測分析を組み合わせた統合的なインシリコワークフローを用いて体系的に評価しました。CAS BioFinderの適用により、科学文献から抽出された精選された化学・生物学的関係に基づき、タンパク質とリガンドの相互作用をデータ駆動型で予測することが可能となりました。CAS BioFinderは、候補リストを66化合物から4つの有望な候補にわずか数分で絞り込むことで、この単一プロジェクトにおいて外部試験費用を少なくとも15,000ドル削減し、初期のプロジェクト設計から生物学的検証までの全体的なプロジェクト期間を8ヶ月に短縮しました。同様のプロジェクトは、CAS BioFinderなしでは数年かかることも珍しくありません。in silicoワークフローを組み合わせ、体系的に評価しました。CAS BioFinderの適用により、科学文献から抽出された精選された化学・生物学的関係に基づき、タンパク質とリガンドの相互作用をデータ駆動型で予測することが可能となりました。CAS BioFinderは、候補リストを66化合物から4つの有望な候補にわずか数分で絞り込むことで、この単一プロジェクトにおいて外部試験費用を少なくとも15,000ドル削減し、初期のプロジェクト設計から生物学的検証までの全体的なプロジェクト期間を8ヶ月に短縮しました。同様のプロジェクトは、CAS BioFinderなしでは数年かかることも珍しくありません。

この分析により、5-アザスピロ[2.3]ヘキサンが、その予測される構造的および相互作用的特徴に基づき、有望なピペリジンバイオアイソスターであることが特定されました。産科鎮痛薬として使用されるピペリジン含有μオピオイド受容体アゴニストであるペチジンをモデルシステムとして使用し、この仮説をその後のインビトロ結合試験を通じて検証しました。in vitro結合試験を通じて検証しました。

全体として、本研究は、CAS BioFinderのような現代のAI対応予測ツールが、標的を絞った化合物選定を導き、新規化学空間の発見からインビトロでの生物学的評価までの期間を短縮することで、合成化学をどのように補完できるかを示しています。CAS BioFinderによる透明性が高く根拠に基づいた予測があれば、合成化学者は、本来の合理的な創薬設計では設計されなかったであろう全く新しい分子の標的をより容易に特定できます。より短く、事前にスクリーニングされた候補リストでインビトロ試験を開始することで、事前検証と焦点の絞り込みにより、インビトロ試験のリスクとコストが低減されます。in vitroでの生物学的評価までの期間を短縮することで、合成化学をどのように補完できるかを示しています。CAS BioFinderによる透明性が高く根拠に基づいた予測があれば、合成化学者は、本来の合理的な創薬設計では設計されなかったであろう全く新しい分子の標的をより容易に特定できます。より短く、事前にスクリーニングされた候補リストでインビトロ試験を開始することで、事前検証と焦点の絞り込みにより、インビトロ試験のリスクとコストが低減されます。in vitro試験を開始することで、事前検証と焦点の絞り込みにより、インビトロ試験のリスクとコストが低減されます。in vitro試験のリスクとコストが低減されます。

本稿で説明したスルホニウム塩試薬は有機合成においてより広く応用されることが期待されており、このスピロ[2.3]ヘキサンへのモジュール式ルートは、予測分析と組み合わせることで、医薬品化学における価値あるコアとしてのこれらのモチーフのさらなる探索を促進するでしょう。

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P.Natho, A.Vicenti, F.Mastrolorito, F.De Franco, L.Walsh-Benn, M.Colella, E.Mesto, E.Schingaro, O.Nicolotti, A.Gioiello, R.Luisi, Angew. Chem. Int. Ed. 2026, 65, e21633.https://doi.org/10.1002/anie.202521633

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