MicroRNAs (miRNA/miR) são RNAs não codificantes curtos de 20 a 22 nucleotídeos que desempenham um papel crítico na regulação gênica ao interagir com moléculas de RNA mensageiro (mRNA) alvo. Estima-se estimado que os microRNAs possam modular até 60% dos genes codificadores de proteínas no genoma humano em nível traducional. Eles participam de vários processos fisiológicos, como diferenciação, proliferação, apoptose e desenvolvimento, e sua desregulação tem sido relacionada a vários distúrbios patológicos.
A importância do microRNA foi destacada pelo Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 2024, concedido a Victor Ambros e Gary Ruvkun “pela descoberta do microRNA e seu papel na regulação gênica pós-transcricional”. Esses cientistas publicaram pela primeira vez sua descoberta do microRNA em 1993 e, em 2000, o grupo de pesquisa de Ruvkun havia identificado o let-7, um microRNA codificado pelo gene let-7, que é altamente conservado em várias espécies animais. Desde então, tem havido um interesse significativo no desenvolvimento de terapias com microRNA.
Problemas com toxicidade e a entrega eficaz desses ácidos nucleicos continuam sendo um desafio. Menos de 20 terapias com microRNA entraram em ensaios clínicos, nenhum dos quais está na fase III. Aproximadamente metade dos ensaios de terapias com microRNA iniciados tiveram que ser suspensos ou encerrados devido à toxicidade do microRNA e outros efeitos colaterais graves.
No entanto, novas pesquisas estão progredindo. Avanços em sistemas de entrega de medicamentos em nanoescala estão abordando questões de eficácia e toxicidade, e as terapias com microRNA podem ser mais amplamente utilizadas à medida que os métodos de entrega continuam a melhorar.
Biogênese do microRNA e mecanismo de ação
O microRNA pode ser encontrado como unidades transcricionais independentes ou inserido em íntrons ou éxons de outros genes. Existem duas vias de biogênese do microRNA: a via canônica e a via não canônica (veja a Figura 1).
Na via canônica, os microRNAs são transcritos a partir de genes de microRNA como longos transcritos primários de microRNA (pri-miRNAs) pela RNA polimerase II (ocasionalmente RNA polimerase III). Pri-miRNAs podem ter vários quilobases de comprimento, com sequências flanqueadoras 5' e 3', e podem conter as alças de grampo de vários microRNAs maduros. Os pri-miRNAs são processados pela proteína nuclear DGCR8 (região crítica 8 da síndrome de DiGeorge) e pela enzima DROSHA em estruturas em forma de grampo chamadas transcritos de pré-miRNA.
Na via não canônica, os precursores de microRNA localizados dentro dos íntrons do mRNA são removidos por splicing, contornando a etapa DGCR8/DROSHA. Os pré-miRNAs são então exportados para o citoplasma com a ajuda da exportina-5. Uma vez no citoplasma, a enzima RNase DICER atua na alça de grampo do pré-miRNA e a cliva para produzir um duplex de microRNA maduro. Uma fita do duplex de microRNA (a fita guia) associa-se à proteína Argonauta (AGO) no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), enquanto a outra fita (fita passageira) é degradada. Normalmente, há uma preferência por qual fita é incorporada ao RISC com base em fatores como a estabilidade termodinâmica. Finalmente, o mRNA alvo é degradado ou sofre supressão traducional.
Métodos de entrega aprimorados aproximam as descobertas
Alcançar a entrega eficaz de terapias com microRNA às células-alvo é um desafio complexo devido à sua instabilidade e suscetibilidade à degradação. As metodologias atuais incluem sistemas virais (vírus adeno-associado, adenovírus e vetores lentivirais) e sistemas não virais (nanopartículas à base de lipídios, nanopartículas poliméricas, nanopartículas inorgânicas, vesículas extracelulares e peptídeos).
A entrega de microRNA mediada por vírus provou ser eficaz, mas esse método também apresenta alta imunogenicidade. Vetores não virais, por outro lado, apresentam estabilidade relativa e baixa imunogenicidade. Como resultado, os pesquisadores estão explorando inúmeros tipos de nanocarreadores não virais para entregar microRNA de forma eficaz às células.
Nanopartículas à base de lipídios (LNPs) são os carreadores mais comumente usados porque protegem o microRNA e possuem boa biocompatibilidade. As LNPs foram recentemente desenvolvidas a partir de lipídios catiônicos ionizáveis para uma entrega mais eficiente do microRNA. As LNPs também podem incluir “lipídios auxiliares” como colesterol ou dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) para melhorar a estabilidade e reduzir a toxicidade. A incorporação de polietilenoglicol (PEG) demonstrou reduzir a agregação das nanopartículas e aumentar o tempo de circulação.
Avanços emergentes também estão ocorrendo com transportadores à base de polímeros, incluindo o ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA). Pesquisadores desenvolveram uma estratégia de inibição do microRNA-210 com ácidos nucleicos peptídicos γ (γPNAs) antissenso com eficácia aprimorada de ligação ao RNA e os encapsularam em nanopartículas de PLGA. O PLGA recebeu aprovação da FDA como veículo de entrega e está em ensaios de fase II para terapias com RNA de interferência pequeno (siRNA).
Nanopartículas inorgânicas, como ouro e sílica, também mostram potencial como transportadores de microRNA, mas preocupações contínuas com a toxicidade, particularmente com o ouro, podem limitar seu uso clínico.
Diferentes estratégias de uso de microRNAs como terapêutica
Examinamos a CAS Content CollectionTM, o maior repositório de informações científicas com curadoria humana, para entender melhor o cenário de pesquisa de microRNA. Houve um aumento notável nas publicações relacionadas ao microRNA nos últimos anos, embora as publicações em periódicos estejam diminuindo ligeiramente agora. No entanto, as publicações de patentes continuam a aumentar, sugerindo um interesse comercial sustentado nesta área (ver Figura 2).
O objetivo das terapias com microRNA é alterar e, idealmente, restaurar padrões anormais ou patológicos de expressão de microRNA. Existem atualmente duas abordagens para alcançar isso: estimuladores ou intensificadores de microRNA e inibidores de microRNA. O primeiro grupo inclui principalmente mímicos de microRNA, enquanto o segundo grupo compreende oligonucleotídeos antiMIR (AMOs), máscaras de microRNA, esponjas e iscas. Como visto na Figura 3, a maioria das publicações refere-se a inibidores de microRNA (67,7%). Os AMOs são os mais comuns entre essas publicações.
Essas várias estratégias funcionam da seguinte forma:
- mímico de microRNA: Pequenas moléculas de RNA sintéticas de fita dupla que correspondem à sequência do microRNA, mimetizando a ação do microRNA sintetizado naturalmente. O objetivo é repor funcionalmente a expressão de microRNA perdida ou diminuída em condições patológicas.
- antiMIRs/AMOs/antagomiRs: Pequenas moléculas de RNA sintéticas de fita simples baseadas em oligonucleotídeos antissenso de primeira geração, que podem ter modificações químicas (por exemplo, antiMIRs com uma modificação 2-O-metoxietil também são chamados de antagomiRs). Eles se ligam funcionalmente a microRNAs com sequências complementares e impedem sua interação com o mRNA alvo, aumentando, por fim, sua expressão.
- esponjas de microRNA: MicroRNA artificial contendo repetições em tandem de sequências de oligonucleotídeos com locais de ligação de microRNA (MBSs) para um microRNA maduro de interesse. Eles sequestram os microRNAs endógenos alvo, deixando os MBSs nos mRNAs alvo livres, levando assim à sua regulação positiva. CircmiRs são esponjas de microRNA circulares com o mesmo mecanismo de ação, mas são mais estáveis.
- iscas de microRNA: Uma variação das esponjas de microRNA caracterizada por estruturas de haste e alça (a alça contém MBSs).
- máscaras de microRNA: Oligonucleotídeos de fita simples com modificação 2ʹ-O-metoxietil (ou outra modificação química). Eles são perfeitamente complementares aos MBSs na 3’UTR do mRNA alvo, dificultando a interação microRNA-mRNA e aumentando os níveis de expressão de mRNA.
Explorando o potencial do microRNA como terapêutica
O microRNA pode tratar uma variedade de doenças devido à sua gama de funções na expressão gênica. De acordo com nossa análise da CAS Content Collection, o câncer é a área terapêutica mais proeminente pesquisada (67,5%), seguida por distúrbios cardiovasculares (10,2%), infecções (4,5%), diabetes (4,4%) e distúrbios neurodegenerativos (4,3%) (ver Figura 4).
Câncer
miRNAs oncogênicos (oncomiRs) influenciam substancialmente o desenvolvimento do câncer ao participar de muitas vias de sinalização, incluindo a supressão de genes supressores de tumor e a ativação de oncogenes. A família miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c), que está sob o controle da regulação do gene supressor de tumor TP53, regula negativamente vários genes, como Ciclina D1, E2, CDK4, CDK6, BCl2 e Myc, levando à interrupção do ciclo celular e apoptose, restringindo o crescimento tumoral. O cluster MiR-17-92, comumente referido como “oncomir-1”, tem como alvo e inibe supressores de tumor como PTEN, p21 e E2F, levando ao aumento da proliferação celular, sobrevivência e angiogênese. O MiR-21 tem como alvo principalmente PTEN, PDCD4 e TIMP3 e ativa vias de suporte à sobrevivência como PI3K/Akt e MAPK, promovendo ainda mais o crescimento tumoral, invasão e metástase. Os microRNAs também desempenham um papel crítico na modulação da resistência a medicamentos das células cancerígenas, além de regular supressores de tumor e oncogenes.
Doenças cardiovasculares
Estudos de perfil recentes identificaram muitos microRNAs que são expressos diferencialmente em doenças cardiovasculares (DCV) de maneira espaço-temporal, apontando para uma nova abordagem para regular condições como infarto do miocárdio, aterosclerose, insuficiência cardíaca, acidente vascular cerebral e hipertensão, entre outras. Exemplos incluem miRNA-29 na fibrose cardíaca, miRNA-21 e miR-155 na cardiomiopatia e miRNA-34 no infarto do miocárdio. O MiR-21 e o miR-29 também desempenham papéis cruciais na deposição da matriz extracelular durante o remodelamento cardíaco patológico. A Dicer, uma enzima necessária para a maturação de todos os microRNAs, apresenta expressão aberrante durante a insuficiência cardíaca. Estudos funcionais demonstraram que o knock-out específico de Dicer no coração leva à cardiomiopatia progressiva, insuficiência cardíaca e morte em camundongos. Os dados disponíveis sugerem coletivamente que a Dicer/microRNAs desempenham papéis críticos nas funções cardíacas normais, bem como em condições patológicas, e estão sendo explorados como alvos terapêuticos em DCV.
Infecções
Os microRNAs estão sendo explorados nas interações hospedeiro-patógeno de mais de 50 infecções (bacterianas, virais, fúngicas e parasitárias). Existem várias maneiras pelas quais os microRNAs podem ajudar a combater doenças infecciosas. Eles regulam proteínas específicas envolvidas nas vias imunes inatas e adaptativas, ajudando a ajustar a resposta imune às infecções. Eles podem ser usados para atingir genes de patógenos e inibir sua replicação. Por exemplo, tratamentos como RG-101 e miravirsen (inibidores de miR-122) têm como alvo microRNAs do hospedeiro para combater a infecção por hepatite C. Os microRNAs também estão sendo investigados para criar vacinas atenuadas, incorporando elementos de resposta ao microRNA nos genomas de vacinas virais. Alguns patógenos, como o Ebola, produzem seus próprios microRNAs, que podem ser alvo para reduzir sua patogenicidade e melhorar os resultados do tratamento.
Diabetes
Evidências emergentes sugerem que os microRNAs desempenham um papel fundamental nas funções das células beta (sobrevivência, proliferação, diferenciação e secreção de insulina) e na modulação da resistência ou sensibilidade à insulina. Eles podem influenciar as respostas inflamatórias, que são tipicamente aumentadas em pacientes diabéticos. Ao reduzir a inflamação, os microRNAs podem ajudar no controle de complicações associadas ao diabetes. Vários ensaios pré-clínicos e estudos in-vitro que visam encontrar terapias baseadas em microRNA para diabetes mostraram resultados promissores.
Doenças neurodegenerativas
Os microRNAs podem regular a expressão de genes envolvidos em doenças neurodegenerativas, reduzir a neuroinflamação e proteger os neurônios da apoptose. Exemplos incluem o miR-124 e o miR-132, que apoiam a saúde e a função neuronal, e as famílias miR-29 e miR-34, que têm como alvo genes associados à produção de beta-amiloide na doença de Alzheimer. Os microRNAs também podem promover a neurogênese, o que é crucial para a reparação cerebral, sendo o miR-9 e o miR-124 conhecidos por desempenharem papéis importantes nesse processo. A desregulação dos microRNAs pode levar à deterioração neurológica e ao desenvolvimento de doenças neurodegenerativas. Portanto, modular esses microRNAs oferece uma nova direção para o tratamento dessas condições.
Mapeamos os microRNAs mais comuns na literatura e visualizamos sua distribuição nas cinco principais áreas terapêuticas como parte de nossa análise (veja a Figura 5).
Também realizamos uma análise de coocorrência para determinar quais tipos de terapias com microRNA estão mais estreitamente associados às cinco principais condições na literatura (veja a Figura 6).
Perspectivas para as terapias com microRNA
Temos visto novos avanços promissores nas terapias com microRNA. No entanto, desafios persistentes precisam ser superados antes que esses tratamentos possam ser usados na prática clínica. Ensaios clínicos devem ser realizados para confirmar a segurança e a eficácia de diferentes estratégias e métodos de entrega de microRNA. Respostas imunes indesejadas, acúmulo não específico em tecidos e degradação endossômica são outros desafios significativos no desenvolvimento de terapias baseadas em microRNA.
Pesquisas recentes demonstram que avanços estão ocorrendo e o futuro dessas terapias é promissor. Tecnologias avançadas como CRISPR/Cas para atingir genes de microRNA e modelos baseados em inteligência artificial para prever alvos de microRNA demonstram oportunidades empolgantes para o desenvolvimento de terapias com microRNA.
As terapias com microRNA podem em breve transformar o atendimento ao paciente para inúmeras doenças por meio da inovação contínua.
