小干扰 RNA (siRNA) 疗法是一类利用 RNA 干扰 (RNAi) 途径来沉默特定基因的药物。这一过程在 1998 年最早发现于秀丽隐杆线虫中，并促进了 siRNA 分子的开发，这些分子针对信使 RNA (mRNA) 以抑制与各种疾病相关的蛋白质的产生。
2006 年，发现 siRNA 介导的基因沉默的科学家获得了诺贝尔生理学或医学奖。首个获批的 siRNA 疗法 patisiran 于 2018 年获得监管部门批准，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性。此后，又有一些 siRNA 药物获得批准：givosiran 用于治疗急性肝性卟啉症、lumasiran 用于治疗 1 型原发性高草酸尿症，以及 inclisiran 用于高胆固醇血症管理。最近获得批准的药物包括 vutrisiran 和 nedosiran，它们进一步将 siRNA 疗法的应用扩展到代谢、心血管和遗传疾病领域。
这些进展确立了 siRNA 作为一种精确的治疗方法在多个临床领域中的地位。从癌症到阿尔茨海默病再到 HIV 等疾病都可能成为 siRNA 治疗的目标。根据 Pharmaproject 的数据，目前有超过 260 种 siRNA 候选药物正在进行临床前或临床开发。
这一前景十分美好，但迄今为止，利用这些疗法进行持续和可靠的药物开发仍面临着重大挑战。未经修饰的 siRNA（未经过化学修饰或未使用专门递送系统的 siRNA）极易被生物液体中无处不在的核糖核酸酶快速降解，从而大大缩短其有效半衰期，并削弱其到达靶细胞的能力。此外，它们固有的负电荷和亲水性阻碍了细胞的有效吸收，使其无法穿过细胞膜并在细胞内达到足够的浓度。如果不进行化学修饰，引起先天性免疫反应的风险也会提高，它有可能引发脱靶炎症通路，并影响整体安全性。
研究人员正在寻找新的突破，以克服这些长期存在的障碍。化学修饰和先进的药物递送系统正在取得进展，因此，siRNA 疗法越来越有可能在多种疾病中增强精准医疗。
siRNA 疗法的工作原理
siRNA 通过保守和受调控的 RNAi 途径介导基因沉默，从而促进转录后特定基因转录本的下调（见图 1）。
外源性施用的 siRNA 双链体通常长度为 21–23 个核苷酸，带有 3′-二核苷酸悬垂。它们被引入细胞质，在那里被多蛋白 RNA 诱导的沉默复合体 (RISC) 识别。RISC 激活的核心是 Argonaute 2 (AGO2) 内切酶，它在双链不依赖 ATP 解旋后选择性地保留引导链，并同时弹出乘客链。
成熟的单链 siRNA-RISC 复合物随后通过沃森-克里克碱基配对与互补的目标 mRNA 转录本结合，主要是在种子区（核苷酸 2–8 位）。在接下来的 siRNA 处理过程中，AGO2 会催化 mRNA 的特异性位点内切核酸裂解，裂解的核苷酸位于引导链 5′ 端 10 和 11 位之间。这种裂解会破坏 mRNA 的稳定性，促使其被细胞质外切酶降解，从而有效地终止转录。
我们分析了全球最大的人工收录科学信息库 CAS 内容合集TM，以更好地了解 siRNA 的研究布局。过去十年，期刊出版物呈现出略微波动的趋势。不过，专利公开数量持续增长，表明该领域保持着商业关注度（见图 2）。
如前所述，siRNA 疗法通过精确沉默推动病理的基因，已迅速发展成为一种前景广阔的治疗模式，适用于多种疾病领域。根据我们对 CAS 内容合集的分析，癌症是研究最为突出的治疗领域 (71%)，其次是传染病 (8%)、神经系统疾病 (6%)、心血管疾病 (5%) 和糖尿病 (5%)（见图 3）。
但是，如果没有化学修饰或先进的药物递送系统，这些疗法就无法发挥其有效治疗疾病的潜力。研究人员正在这两个领域取得进展，以确保 siRNA 能够被输送并维持在治疗水平。
例如，化学修饰（如加入 2′-O-甲基、2′-氟基团和硫代磷酸酯键）可增强核酸酶抗性，提高结合亲和力，降低免疫原性，从而稳定循环中的 siRNA。与此同时，脂质纳米颗粒 (LNP)、聚合物载体和靶向偶联物等高级递送系统通过促进内体逃逸和实现组织特异性分布，对克服 siRNA 吸收的物理障碍至关重要。让我们更详细地探讨这些创新：
siRNA 疗法的化学修饰
化学修饰解决了未修饰 siRNA 的几个局限性，包括易受核酸酶的影响、肾脏清除快和潜在的免疫原性，同时还微调了结合亲和力和靶向特异性等性质。这些修饰通常根据它们影响的 siRNA 分子的结构成分进行分类：糖（核糖）、磷酸骨架、核碱基、末端基团以及与其他部分的偶联。
化学修饰的选择和组合取决于几个因素：保持 RNAi 活性、提高稳定性、降低免疫原性、优化药代动力学以及成本效益。虽然一些修饰能带来实质性的好处，但它们必须与设计复杂性的增加以及大规模生产的合成成本相平衡。
糖（核糖）修饰
核糖 2′ 位的修饰是最常用的修饰之一。
- 2′-O-甲基 (2′-OMe) 基团可提高抗核酸酶能力，并减少免疫刺激。
- 2'-O-甲氧基乙基 (2'-MOE) 修饰可进一步增强稳定性并降低毒性。
- 2′-氟 (2′-F) 取代可保持高活性，同时显著提高抗酶降解性。
- 2′-O-烯丙基修饰用于调节药代动力学性质，为全身循环提供益处。
锁核酸 (LNA) 等构象修饰具有受限的双环结构，也能赋予较高的结合亲和力，而非锁核酸 (UNA) 在骨架中引入了灵活性，有可能减少脱靶相互作用。2′-4′ 桥接核酸还可通过提高构象刚性来增强靶向特异性。
磷酸骨架修饰
siRNA 的磷酸骨架对于分子稳定性和细胞摄取至关重要。
- 硫代磷酸酯 (PS) 修饰涉及用硫取代非桥氧，从而显著提高对核酸酶活性的抗性。
- 二硫代磷酸酯修饰（即两个非桥氧基都被硫取代）可提供更高水平的保护。
- 磷酸硼修饰结合了一个硼烷分子，改变了骨架的性质，而甲基膦酸修饰则使骨架呈中性，降低了免疫原性，同时又不影响细胞递送。
碱基修饰
核碱基修饰旨在调节免疫传感器的识别并改变结合亲和力，并且不破坏沃森-克里克碱基配对。
- 5-甲基胞嘧啶掺入可降低免疫激活。
- 假尿嘧啶可提高整体 RNA 稳定性，同时减轻免疫反应。
- 2-硫代尿苷用于增强定向结合，而肌苷则可实现摇摆碱基配对，这有助于减少意外的脱靶效应。
末端和偶联修饰
末端修饰可进一步增强 siRNA 的药理特性。在 5′ 端，使用磷酸盐去除或临时硅基保护等修饰方法，可减少递送过程中的免疫识别。在 3′ 端，胆固醇的偶联或氨基的添加有助于改善细胞膜的相互作用和吸收。靶向配体（包括用于肝细胞识别的 GalNAc、用于癌细胞靶向的叶酸，以及用于组织特异性递送的适配体或抗体）可进一步完善 siRNA 的生物分布。
稳定性和基于模式的修改
其他策略包括通过悬垂和内部修饰来调整结构。垂悬修饰（如加入 dTdT 核苷酸或化学修饰的垂悬）可提高对核酸酶的抵抗力。基于模式的修饰包括不对称修饰和特定位置修饰。例如，在乘客链上进行重度修饰而在引导链上进行轻度修饰，可使 RNAi 机器偏向所需的功能链，而在 RISC 负载和活性的关键位置（如末端、中心或种子区）进行有针对性的改变，可进一步提高特异性和活性。
高级修饰
除了传统的修饰外，乙二醇核酸 (GNA)、肽核酸 (PNA)、吗啉基修饰和三环 DNA 等先进的类似物代表了完全改变骨架结构的创新方法。这些修饰可提供增强稳定性、特异性和整体药理作用的替代方法，有时还可引入传统 RNA 修饰无法实现的全新性质。
siRNA 疗法的递送系统
siRNA 研究已经取得了重大进展，解决了稳定性差、细胞吸收率低、毒性和脱靶效应等长期存在的挑战。在 CAS 内容合集的分析中，我们查找了常用的 siRNA 递送系统，发现大多数出版物 (63%) 提到了非病毒递送系统，而 37% 提到了基于病毒载体的递送系统（见图 4A）。
我们进一步分析了过去几年中每个系统的出版物数量趋势（见图 4B）。在过去几年中，基于脂质的载体在出版物数量上显示出最显著的提高，而 siRNA 偶联物也显示出细微的增长。病毒载体和基于聚合物的载体有类似的趋势，而无机纳米颗粒似乎在过去几年中趋于稳定。
病毒载体具有天然的细胞进入机制，因此转染效率很高，并且在某些情况下，它们可以通过对衣壳的工程化修饰实现组织特异性靶向。例如，AAV 载体因其低免疫原性和明确的组织嗜性，已被用于神经和眼部疾病的临床试验，而慢病毒系统则继续在针对癌基因的临床前基因沉默研究中发挥重要作用。
脂质基载体仍然是临床上最先进的平台。LNP 结合了可电离脂质、辅助脂质、PEG 化脂质和胆固醇，目前已成为 siRNA 递送的标准，美国 FDA 批准用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性的 Patisiran 就是一例。阳离子和中性脂质体形式的脂质体添加了对 pH 值敏感的脂质，可以更好地进行内泌体逸散，目前人们正在对其进行临床和临床前评估，以用于多种适应症，包括癌症和遗传性疾病。固体脂质纳米颗粒 (SLN) 和脂质复合物通过提供可控释放特性和可扩展的生产工艺，进一步促进了脂质平台的多样性（参考文献）。
基于聚合物的载体通过利用 siRNA 与阳离子聚合物的静电络合来扩展这些递送选择，从而提高细胞吸收率并促进内体逃逸。聚乙烯亚胺 (PEI)、多聚赖氨酸 (PLL)、壳聚糖和 PAMAM 树枝状分子等材料已经过优化，可用于治疗炎症、神经和肿瘤疾病。研究人员还设计了聚（β-氨基酯）等合成聚合物和透明质酸等天然聚合物，用于靶向递送，其修饰可实现受体介导的吸收。
无机纳米颗粒作为 siRNA 载体也备受关注。金纳米颗粒 (AuNP) 可以通过阳离子聚合物进行功能化，以确保 siRNA 的安全结合，并且研究人员已在癌症模型中评估其光热发布机制。介孔二氧化硅纳米颗粒具有可调孔径和表面氨基功能化，已被设计用于在肿瘤微环境中控制 siRNA 的释放。由氧化铁组成的磁性纳米颗粒提供了通过外部磁场定向递送和通过 MRI 实时成像的双重优势，这为其在诊断和治疗中的应用提供了支持。
直接化学连接策略为 siRNA 递送提供了另一种有效途径。通过将 siRNA 与 GalNAc 簇等靶向配体共价连接，研究人员实现了通过 Asialoglycoprotein 受体进行肝细胞特异性递送，这已被证明对肝脏疾病至关重要。包括胆固醇、脂肪酸、胆汁酸和细胞穿透肽在内的其他共轭分子可提高细胞吸收率，改善药代动力学，从而将潜在的治疗应用扩大到癌症和代谢紊乱领域。值得注意的是，在美国 FDA 批准的六种 siRNA 疗法中，有五种含有 GalNac 修饰。
利用天然材料和生物反应性材料的其他先进递送系统也在不断涌现。外泌体是一种细胞衍生的囊泡，以其天然的通讯作用和穿越生物屏障（如血脑屏障）的能力而闻名；它们正被改进为中枢神经系统疾病中 siRNA 的载体。与此同时，设计用于响应特定触发因素（如 pH 值变化、酶活性、氧化还原条件甚至光照）释放 siRNA 的生物响应材料正在实体肿瘤模型和胰腺癌中进行临床前评估。此外，RNAi 微海绵通过将 siRNA 封装在多孔海绵状结构中，为 RNAi 治疗提供了一种新方法，与传统的 siRNA 递送方法相比，这种方法有可能提高递送效率和稳定性。
总之，这些多样化的递送平台不仅提高了 siRNA 的稳定性、生物分布和细胞吸收，还扩展了其临床应用范围，从肝脏和遗传疾病扩展到了肿瘤学和中枢神经系统疾病。先进材料科学与分子靶向策略的整合正在为下一代 siRNA 疗法铺平道路，为各种疾病领域提供更精确、有效和安全的治疗方式。
siRNA疗法在当今精准医学中的应用
siRNA 疗法的化学修饰和递送系统的发展推动了利用这些药物治疗各种疾病的研究。如图 3 所示，探索最多的靶点包括癌症和心血管疾病，但还有其他令人感兴趣的领域：
- 癌症：临床前研究和早期临床试验已经在各种癌症中探索了 KRAS、VEGF、EGFR、HER2 和 c-MYC 等靶点。这些靶点是肿瘤生长、血管生成和免疫逃逸的关键。早期研究结果表明，这些驱动因素下调会对肿瘤的消退和转移产生显著影响。然而，肿瘤的异质性和肿瘤微环境的复杂性仍然是重大挑战，因此有必要开发先进的递送系统，如定制的脂质纳米颗粒或受体特异性偶联物，以确保 siRNA 有效和安全地到达目标细胞。最近的研究表明，在与化疗药物或免疫检查点抑制剂联合使用时，它们在癌症治疗中具有额外的潜力。
- 心血管疾病：siRNA方法已经达到了一个重要的里程碑，随着以 PCSK9 为靶点的药物（如 inclisiran）获得批准，它能有效降低低密度脂蛋白胆固醇水平。其他靶点（如 ANGPTL3、APOB 和 LPA 正在研究中）；早期临床数据表明，精确的肝脏靶点可有效调节血脂状况。
- 神经系统和神经退行性疾病：使用 siRNA 靶向 APP、BACE1、tau 和 α-突触核蛋白等蛋白质，有望治疗阿尔茨海默病、帕金森病和渐冻症等疾病。然而，血脑屏障仍然是一个具有挑战性的障碍，促使人们探索直接递送方法（例如鞘内注射）或新型纳米颗粒载体，以增强中枢神经系统的吸收率。
- 传染病：研究团队目前正在评估 siRNA 抑制病毒基因的能力，如靶向 HBV 转录本或 HIV 监管蛋白的候选药物，以及在 SARS-CoV-2 中调节 ACE2 等宿主因子的能力。尽管这些策略在早期研究中显示出令人鼓舞的病毒载量降低效果，但病毒的快速变异和先天性免疫反应的潜在激活仍然带来持续的挑战。
- 糖尿病：siRNA 疗法在糖尿病临床阶段的应用仍处于起步阶段。不过，一些临床前研究强调，沉默 PTP1B、TXNIP 和 FOXO1 等靶点有可能会增强胰岛素信号传导并保护 β 细胞功能。新陈代谢调节本身的复杂性，以及在不产生脱靶效应的情况下实现 siRNA 的组织特异性传递的难度，使临床应用的过程变得更加复杂。其他研究使用了 siRNA 介导的沉默方法来研究 GLUT4 和 GSK3B 等重要蛋白质在胰岛素信号传导中的作用。
siRNA 研究的扩展凸显出以下事实：针对这些疾病类别的数百种候选药物正处于临床前和临床开发阶段（见图 5）。有四种药物处于 III 期临床开发阶段，分别用于动脉粥样硬化（诺和诺德/礼来）、亨廷顿病（Ionis Pharmaceuticals/罗氏）、强直性肌营养不良症 (Avidity Biosciences) 和肝炎感染 (Alnylam Pharmaceuticals/Vir Biotech)。心血管疾病、神经系统疾病和癌症是候选药物研发数量最多的三大治疗领域。
siRNA 疗法的前景
虽然肝脏仍然是 siRNA 研究的主要目标，但研究人员目前正在努力设计针对其他器官（如大脑、肺、肾和实体瘤）的递送系统。这涉及开发新的配体和纳米颗粒配方，以克服血脑屏障等生物屏障。
在肿瘤学中，siRNA 策略旨在抑制关键致癌基因并抵消耐药性，早期研究取得了可喜的成果。脂质载体、聚合物载体和外泌体递送方法的进步有望提高组织靶向的精度和效率。增强的化学修饰可继续提高 siRNA 的稳定性并降低免疫反应，从而扩大治疗窗口。
这些进展可能会使 siRNA 疗法在一系列疾病中得到更广泛的批准和临床应用，为全球患者带来希望，是精准医疗的重要进步。
