Novos avanços em terapias com siRNA expandem o pipeline de medicamentos

O que é siRNA (RNA de interferência pequeno)?

O siRNA é uma molécula que silencia genes. Essa característica o tornou um veículo popular para novas terapias que utilizam a via de interferência de RNA (RNAi) para silenciar genes específicos. Esse processo foi relatado pela primeira vez em Caenorhabditis elegans em 1998 e levou ao desenvolvimento de moléculas de siRNA que visam o RNA mensageiro (mRNA) para suprimir a produção de proteínas implicadas em várias doenças.

Em 2006, os cientistas que descobriram o silenciamento gênico mediado por siRNA receberam o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina. O primeiro tratamento com siRNA aprovado, o patisiran, recebeu autorização regulatória em 2018 para o tratamento da amiloidose hereditária mediada por transtirretina. Desde então, outros medicamentos de siRNA foram aprovados: givosiran para porfiria hepática aguda, lumasiran para hiperoxalúria primária tipo 1 e inclisiran para o controle da hipercolesterolemia. Aprovações mais recentes incluem vutrisiran, nedosiran, fitusiran e plozasiran, que ampliam ainda mais a aplicação de terapias com siRNA em distúrbios metabólicos, cardiovasculares e genéticos.  

Esses avanços estabeleceram o siRNA como uma abordagem terapêutica precisa em diversas áreas clínicas. Condições que vão desde câncer até Alzheimer e HIV podem ser alvos de terapias com siRNA e, de acordo com a Pharmaproject, existem mais de 260 candidatos a medicamentos de siRNA em desenvolvimento pré-clínico ou clínico.  

Isso é promissor, mas até o momento houve desafios significativos para o desenvolvimento consistente e confiável de medicamentos com essas terapias. Os siRNAs não modificados — aqueles administrados sem modificações químicas ou sistemas de entrega especializados — são altamente suscetíveis à degradação rápida por ribonucleases onipresentes em fluidos biológicos, o que reduz drasticamente sua meia-vida efetiva e prejudica sua capacidade de atingir as células-alvo. Além disso, sua carga negativa inerente e natureza hidrofílica dificultam a absorção celular eficiente, impedindo-os de atravessar as membranas celulares e atingir concentrações intracelulares adequadas. Sem modificações químicas, há também um risco aumentado de provocar respostas imunes inatas, potencialmente desencadeando vias inflamatórias fora do alvo e comprometendo a segurança geral.

Os pesquisadores estão encontrando novos avanços que podem superar esses obstáculos persistentes. Modificações químicas e sistemas avançados de entrega de medicamentos estão mostrando progresso e, como resultado, as terapias com siRNA estão cada vez mais próximas de aprimorar a medicina de precisão em inúmeras doenças.  

Como funcionam as terapias com siRNA

O siRNA medeia o silenciamento gênico por meio de uma via de RNAi conservada e regulada, que facilita a regulação negativa pós-transcricional de transcritos gênicos específicos (veja a Figura 1).  

Duplexes de siRNA administrados exogenamente têm tipicamente de 21 a 23 nucleotídeos de comprimento com saliências de dinucleotídeos 3′. Eles são introduzidos no citosol, onde são reconhecidos pelo complexo multiproteico de silenciamento induzido por RNA (RISC). Fundamental para a ativação do RISC é a endonuclease Argonaute 2 (AGO2), que retém seletivamente a fita guia após o desenrolamento do duplex independente de ATP e a consequente ejeção da fita passageira.

O complexo siRNA-RISC maduro de fita simples engaja-se subsequentemente em transcritos de mRNA alvo complementares por meio de pareamento de bases de Watson-Crick, predominantemente dentro da região semente (nucleotídeos 2–8). Durante as próximas etapas do processamento do siRNA, a AGO2 catalisa a clivagem endonucleolítica sítio-específica do mRNA entre os nucleotídeos correspondentes às posições 10 e 11 a partir da extremidade 5′ da fita guia. Essa clivagem interrompe a estabilidade do mRNA, provocando sua degradação por exonucleases citoplasmáticas e anulando efetivamente a tradução.

Examinamos a CAS Content Collection^TM, o maior repositório de informações científicas com curadoria humana, para entender melhor o cenário de pesquisa de siRNA. Há uma tendência de leve oscilação relacionada às publicações em periódicos nos últimos dez anos. No entanto, as publicações de patentes continuam a aumentar, sugerindo um interesse comercial sustentado nesta área (veja a Figura 2).

Como observado, as terapias com siRNA evoluíram rapidamente para uma modalidade promissora em diversas áreas de doenças, silenciando precisamente os genes que impulsionam a patologia. De acordo com nossa análise da CAS Content Collection, o câncer é a área terapêutica mais proeminente pesquisada (71%), seguida por doenças infecciosas (8%), condições neurológicas (6%), distúrbios cardiovasculares (5%) e diabetes (5%) (veja a Figura 3).

No entanto, sem modificações químicas ou sistemas avançados de entrega de medicamentos, essas terapias não podem atingir seu potencial para tratar doenças de forma eficaz. Os pesquisadores estão fazendo progressos nessas duas áreas que podem garantir que os siRNAs sejam entregues e mantidos em níveis terapêuticos.

Por exemplo, modificações químicas como a incorporação de grupos 2′-O-metil, 2′-flúor e ligações fosforotioato aumentam a resistência à nuclease, melhoram a afinidade de ligação e reduzem a imunogenicidade, estabilizando assim os siRNAs na circulação. Ao mesmo tempo, sistemas de entrega avançados como nanopartículas lipídicas (LNPs), transportadores à base de polímeros e conjugados direcionados são fundamentais para superar as barreiras físicas à captação de siRNA, facilitando o escape endossômico e permitindo a distribuição específica para o tecido. Vamos explorar essas inovações com mais detalhes:

Modificações químicas de terapias com siRNA

As modificações químicas abordam várias limitações dos siRNAs não modificados, incluindo a suscetibilidade a nucleases, a rápida depuração renal e a potencial imunogenicidade, ao mesmo tempo em que ajustam propriedades como afinidade de ligação e especificidade do alvo. Essas modificações são geralmente categorizadas com base no componente estrutural da molécula de siRNA que afetam: o açúcar (ribose), a estrutura de fosfato, as nucleobases, os grupos terminais e a conjugação a outras frações.  

A seleção e a combinação de modificações químicas são ditadas por vários fatores: preservação da atividade de RNAi, aumento da estabilidade, redução da imunogenicidade, otimização farmacocinética e custo-benefício. Embora algumas modificações ofereçam benefícios substanciais, elas devem ser equilibradas com o aumento da complexidade no design e o custo de síntese para produção em larga escala.  

Modificações no açúcar (ribose)

As modificações na posição 2′ da ribose estão entre as mais empregadas.

• Grupos 2′-O-metil (2′-OMe) melhoram a resistência à nuclease e reduzem a estimulação imune.
• Modificações 2′-O-metoxietil (2′-MOE) aumentam ainda mais a estabilidade e diminuem a toxicidade.
• Substituições 2′-flúor (2′-F) mantêm alta atividade enquanto melhoram significativamente a resistência à degradação enzimática.
• Modificações 2′-O-alil são usadas para ajustar propriedades farmacocinéticas, oferecendo benefícios na circulação sistêmica.

Modificações conformacionais como o Ácido Nucleico Bloqueado (LNA), com sua estrutura bicíclica restrita, também conferem alta afinidade de ligação, enquanto o Ácido Nucleico Desbloqueado (UNA) introduz flexibilidade na estrutura, potencialmente reduzindo interações fora do alvo. Os ácidos nucleicos em ponte 2′-4′ também são empregados para aumentar a especificidade do alvo por meio de uma rigidez conformacional aprimorada.

Modificações na estrutura de fosfato

A estrutura de fosfato dos siRNAs é fundamental para a estabilidade molecular e a captação celular.

• As modificações de fosforotioato (PS) envolvem a substituição de um oxigênio não ligante por enxofre, aumentando significativamente a resistência à atividade da nuclease.
• As modificações de fosforoditioato, onde ambos os oxigênios não ligantes são substituídos por enxofre, oferecem um nível ainda maior de proteção.
• As modificações de boranofosfato incorporam uma fração borano, alterando as propriedades da estrutura, enquanto as modificações de metilfosfonato tornam a estrutura neutra, reduzindo a imunogenicidade sem comprometer a entrega celular.

Modificações de base

As modificações nas nucleobases são projetadas para modular o reconhecimento por sensores imunológicos e alterar as afinidades de ligação sem interromper o pareamento de bases de Watson-Crick.

• A incorporação de 5-metilcitosina pode reduzir a ativação imunológica.
• A pseudouridina aumenta a estabilidade geral do RNA enquanto mitiga as respostas imunológicas.
• A 2-tiouridina é usada para impulsionar a ligação direcional, e a inosina permite o pareamento de bases oscilante (wobble), o que pode ajudar a reduzir efeitos fora do alvo não intencionais.

Modificações terminais e de conjugação

As modificações terminais aprimoram ainda mais o perfil farmacológico dos siRNAs. Na extremidade 5′, modificações como a remoção de fosfato ou a proteção temporária com silil são usadas para reduzir o reconhecimento imunológico durante a entrega. Na extremidade 3′, a conjugação de colesterol ou a adição de grupos amino facilitam uma melhor interação e absorção pela membrana celular. Ligantes de direcionamento, incluindo GalNAc para reconhecimento de hepatócitos, folato para direcionamento a células cancerígenas e aptâmeros ou anticorpos para entrega específica em tecidos, refinam ainda mais a biodistribuição dos siRNAs.

Estabilização e modificações baseadas em padrões

Estratégias adicionais envolvem a personalização da estrutura por meio de modificações em saliências (overhangs) e internas. Modificações em saliências, como a incorporação de nucleotídeos dTdT ou saliências quimicamente modificadas, aumentam a resistência às nucleases. As modificações baseadas em padrões incluem alterações assimétricas e específicas de posição. Por exemplo, uma modificação intensa na fita passageira em comparação com uma mínima na fita guia pode direcionar a maquinaria de RNAi para a fita funcional desejada, e alterações direcionadas em posições críticas para o carregamento e atividade do RISC (por exemplo, regiões terminais, centrais ou de semente) podem refinar ainda mais a especificidade e a atividade.

Modificações avançadas

Além das modificações tradicionais, análogos avançados como o ácido nucleico glicólico (GNA), o ácido nucleico peptídico (PNA), as modificações de morfolino e o tricyclo-DNA representam abordagens inovadoras para alterar completamente a estrutura da cadeia principal. Essas modificações fornecem métodos alternativos para aumentar a estabilidade, a especificidade e o comportamento farmacológico geral, às vezes introduzindo propriedades totalmente novas que não podem ser obtidas com as modificações clássicas de RNA.

Sistemas de entrega para terapias com siRNA

Houve avanços significativos na pesquisa de siRNA para enfrentar desafios de longa data, como baixa estabilidade, baixa absorção celular, toxicidade e efeitos fora do alvo. Em nossa análise da CAS Content Collection, buscamos sistemas de entrega comumente usados para a administração de siRNA e descobrimos que a maioria das publicações (63%) menciona sistemas de entrega não virais, enquanto 37% mencionam sistemas de entrega baseados em vetores virais (veja a Figura 4A).

Analisamos ainda a tendência no número de publicações nos últimos anos para cada um desses sistemas (veja a Figura 4B). Os vetores baseados em lipídios mostram o aumento mais proeminente em termos de publicações nos últimos anos, enquanto os conjugados de siRNA também apresentam um aumento sutil. Vetores virais e vetores baseados em polímeros seguem uma tendência semelhante, enquanto as nanopartículas inorgânicas parecem ter se estabilizado nos últimos anos.

Vetores virais proporcionam altas eficiências de transfecção devido aos seus mecanismos naturais de entrada celular e, em alguns casos, permitem o direcionamento específico para tecidos por meio de modificações de capsídeo projetadas. Por exemplo, vetores AAV têm sido explorados em ensaios clínicos para distúrbios neurológicos e oculares devido à sua baixa imunogenicidade e tropismo tecidual definido, enquanto sistemas lentivirais continuam sendo fundamentais em estudos pré-clínicos de silenciamento gênico direcionados a oncogenes.

Vetores baseados em lipídios permanecem como a plataforma clinicamente mais avançada. As LNPs, que combinam lipídios ionizáveis, lipídios auxiliares, lipídios peguilados, e colesterol, são agora padrão na entrega de siRNA, como exemplificado pela terapia patisiran, aprovada pela FDA para amiloidose hereditária mediada por transtirretina. Lipossomas, em suas formas catiônicas e neutras com adição de lipídios sensíveis ao pH para melhor escape endossômico, também estão sob avaliação clínica e pré-clínica para inúmeras indicações, incluindo câncer e distúrbios genéticos. Nanopartículas lipídicas sólidas (SLNs) e lipoplexos contribuem ainda mais para a diversidade de plataformas baseadas em lipídios, oferecendo perfis de liberação controlada e processos de produção escaláveis.

Vetores baseados em polímeros ampliam essas opções de entrega ao aproveitar a complexação eletrostática do siRNA com polímeros catiônicos, aumentando assim a absorção celular e facilitando o escape endossômico. Materiais como polietilenimina (PEI), poli-L-lisina (PLL), quitosana e dendrímeros PAMAM foram otimizados para uso em doenças inflamatórias, neurológicas e oncológicas. Pesquisadores também projetaram polímeros sintéticos como poli(β-amino ésteres) e polímeros naturais, incluindo ácido hialurônico para entrega direcionada, onde modificações permitem a absorção mediada por receptores.

Nanopartículas inorgânicas também atraíram atenção como transportadores de siRNA. Nanopartículas de ouro (AuNPs) podem ser funcionalizadas com polímeros catiônicos para garantir uma ligação segura do siRNA e foram avaliadas em modelos de câncer por seus mecanismos de liberação fototérmica. Nanopartículas de sílica mesoporosa, com seus tamanhos de poro ajustáveis e funcionalização de amino na superfície, foram projetadas para a liberação controlada de siRNA no microambiente tumoral. Nanopartículas magnéticas, compostas de óxidos de ferro, oferecem os benefícios duplos de entrega direcionada por meio de campos magnéticos externos e imagem em tempo real via ressonância magnética, o que apoia seu uso em diagnósticos e terapias.

Estratégias de conjugação química direta fornecem outra rota eficiente para a entrega de siRNA. Ao ligar o siRNA covalentemente a ligantes de direcionamento, como clusters de GalNAc, pesquisadores alcançaram a entrega específica para hepatócitos via receptor de asialoglicoproteína, o que provou ser crítico para doenças hepáticas. Outras porções conjugadas, incluindo colesterol, ácidos graxos, ácidos biliares e peptídeos de penetração celular, aumentam a absorção celular e melhoram a farmacocinética, ampliando assim as potenciais aplicações terapêuticas para incluir cânceres e distúrbios metabólicos. É interessante notar que, das oito terapias com siRNA aprovadas pela FDA, sete possuem modificação com GalNAc.

Outros sistemas de entrega avançados estão surgindo e capitalizando materiais naturais e biorresponsivos. Exossomos, as vesículas derivadas de células conhecidas por seus papéis inatos de comunicação e capacidade de atravessar barreiras biológicas como a barreira hematoencefálica, estão sendo refinados como transportadores de siRNA em distúrbios do SNC. Paralelamente, materiais biorresponsivos projetados para liberar siRNA em resposta a gatilhos específicos, como mudanças de pH, atividade enzimática, condições redox ou até mesmo exposição à luz, estão passando por avaliação pré-clínica em modelos de tumores sólidos e câncer pancreático. Além disso, as microesponjas de RNAi oferecem uma abordagem inovadora para a terapia de RNAi ao encapsular o siRNA dentro de uma estrutura porosa semelhante a uma esponja, potencialmente melhorando a eficiência e a estabilidade da entrega em comparação com os métodos tradicionais.

Coletivamente, essas diversas plataformas de entrega não apenas melhoram a estabilidade, a biodistribuição e a absorção celular dos siRNAs, mas também expandem o leque de aplicações clínicas, desde doenças hepáticas e genéticas até oncologia e distúrbios do SNC. A integração da ciência dos materiais avançados com estratégias de direcionamento molecular está abrindo caminho para a próxima geração de terapias com siRNA, oferecendo modalidades de tratamento mais precisas, eficazes e seguras em diversas áreas de doenças.

Terapias com siRNA na medicina de precisão atual

Os avanços nas modificações químicas e nos sistemas de entrega de terapias com siRNA estão impulsionando o aumento das pesquisas sobre o uso desses medicamentos no tratamento de diversas doenças. Como observado na Figura 3, os alvos mais explorados incluem câncer e doenças cardiovasculares, mas existem outras áreas de interesse:

• Câncer: Estudos pré-clínicos e ensaios clínicos de fase inicial exploraram alvos como KRAS, VEGF, EGFR, HER2 e c-MYC em vários tipos de câncer. Esses alvos são fundamentais para o crescimento tumoral, angiogênese e evasão imune. Descobertas iniciais sugerem que, quando esses impulsionadores são regulados negativamente, há um efeito notável na regressão tumoral e na metástase. No entanto, a natureza heterogênea dos tumores e a complexidade do microambiente tumoral continuam sendo desafios significativos, exigindo o desenvolvimento de sistemas de entrega avançados, como nanopartículas lipídicas personalizadas ou conjugados específicos para receptores, para garantir que o siRNA alcance as células pretendidas de forma eficaz e segura. Estudos recentes mostraram seu potencial adicional no tratamento do câncer em combinação com quimioterápicos ou inibidores de checkpoint imunológico. ‍
• Doenças cardiovasculares: As abordagens com siRNA já alcançaram um marco importante com a aprovação de medicamentos como o inclisiran, que tem como alvo a PCSK9 para reduzir de forma robusta os níveis de colesterol LDL. Outros alvos, como ANGPTL3, APOB e LPA, estão sob investigação, com dados clínicos iniciais sugerindo que o direcionamento hepático preciso pode modular eficazmente os perfis lipídicos.  ‍
• Condições neurológicas e neurodegenerativas: O uso de siRNAs para atingir proteínas como APP, BACE1, tau e α-sinucleína oferece esperança para doenças como Alzheimer, Parkinson e ELA. No entanto, a barreira hematoencefálica continua a apresentar um obstáculo desafiador, levando à exploração de métodos de entrega direta (por exemplo, injeções intratecais) ou novos transportadores de nanopartículas para aumentar a absorção pelo sistema nervoso central. ‍
• Doenças infecciosas: Os siRNAs estão sendo avaliados por sua capacidade de silenciar genes virais, como visto em candidatos que visam transcritos do HBV ou proteínas reguladoras do HIV e para modular fatores do hospedeiro como a ACE2 no contexto do SARS-CoV-2. Embora essas estratégias tenham mostrado reduções encorajadoras na carga viral em estudos iniciais, a rápida mutação viral e a potencial ativação de respostas imunes inatas representam desafios contínuos.  ‍
• Diabetes: A translação de terapias com siRNA para fases clínicas no diabetes ainda está surgindo. No entanto, vários estudos pré-clínicos destacaram o potencial de silenciar alvos como PTP1B, TXNIP e FOXO1 para melhorar a sinalização da insulina e preservar a função das células beta. A complexidade inerente da regulação metabólica e a dificuldade em alcançar a entrega tecidual específica dos siRNAs sem efeitos fora do alvo complicam ainda mais a jornada rumo à aplicação clínica. Outros estudos utilizaram abordagens de silenciamento mediado por siRNA para estudar o papel de proteínas importantes como GLUT4 e GSK3B na sinalização da insulina.  

O que reforça a expansão da pesquisa em siRNAs é o fato de que centenas de candidatos a medicamentos estão em desenvolvimento pré-clínico e clínico nessas categorias de doenças (veja a Figura 5). Quatro medicamentos estão em desenvolvimento clínico de fase III, para aterosclerose (Novo Nordisk/Eli Lilly), doença de Huntington (Ionis Pharmaceuticals/Roche), distrofia miotônica (Avidity Biosciences) e infecção por hepatite (Alnylam Pharmaceuticals/Vir Biotech). Distúrbios cardiovasculares, distúrbios neurológicos e cânceres são as três principais áreas terapêuticas em número de candidatos a medicamentos em desenvolvimento.  

Perspectivas para terapias com siRNA

Embora o fígado continue sendo o principal alvo na pesquisa de siRNA, os esforços atuais estão projetando sistemas de entrega voltados para outros órgãos, como cérebro, pulmões, rins e tumores sólidos. Isso envolve o desenvolvimento de novos ligantes e formulações de nanopartículas que podem superar barreiras biológicas, como a barreira hematoencefálica.

Na oncologia, as estratégias de siRNA visam suprimir oncogenes-chave e combater a resistência a medicamentos, com resultados promissores surgindo de estudos iniciais. Espera-se que os avanços em transportadores à base de lipídios, vetores poliméricos e métodos de entrega por exossomos aumentem a precisão e a eficiência do direcionamento tecidual. Modificações químicas aprimoradas continuam a melhorar a estabilidade do siRNA e a reduzir as respostas imunes, resultando em uma janela terapêutica maior.

Esses desenvolvimentos podem resultar em uma aprovação mais ampla e na aplicação clínica de terapias com siRNA em diversas doenças, oferecendo esperança a pacientes em todo o mundo com avanços importantes na medicina de precisão.