La transcriptómica espacial supone un avance significativo en la investigación biológica, al ofrecer una técnica potente para examinar la compleja relación entre la expresión génica y la organización espacial dentro de un tejido intacto. Al revelar la disposición espacial de los componentes celulares y sus estados transcripcionales, este método permite una comprensión más profunda de la composición y la actividad celular en sistemas biológicos complejos.
Transcriptómica espacial abarca varios métodos que comparten el objetivo de asignar datos transcriptómicos a la ubicación original de las moléculas de ARN dentro del tejido. Este avance tecnológico proporciona información sin precedentes sobre la organización, la función y las interacciones de las células dentro de tejidos complejos. Debido a su potencial para mejorar numerosos campos biológicos y médicos, como la biología del desarrollo, la neurociencia y la investigación del cáncer, la transcriptómica espacial fue reconocida como “Método del año” por Nature Methods en 2020.
Otros enfoques transcriptómicos existen en la biomedicina, pero los investigadores han logrado avances interesantes con la transcriptómica espacial recientemente. Examinamos la CAS Content CollectionTM, el mayor repositorio de información científica catalogado por expertos humanos, para comprender mejor el panorama de investigación de la transcriptómica espacial durante la última década. Observamos un aumento enorme (alrededor de 150 veces) en las publicaciones relacionadas con la transcriptómica espacial desde hace 10 años (véase la Figura 1). Las publicaciones en revistas dominan la bibliografía en comparación con las patentes, lo que sugiere que todavía existe una gran oportunidad para la comercialización.
¿Cómo está cambiando la ciencia de la transcriptómica y qué significa esto para los nuevos enfoques de tratamiento de diversas enfermedades? Exploremos cómo funciona la transcriptómica espacial y hacia dónde se dirige la investigación.
¿Qué es la transcriptómica espacial?
Actualmente existen tres tipos principales de transcriptómica: masiva (bulk), de célula única y espacial (ver Figura 2). La transcriptómica masiva analiza la expresión génica en una mezcla de células, proporcionando una visión global pero careciendo de resolución a nivel de célula única. La transcriptómica de célula única resuelve la expresión génica en células individuales, lo que permite obtener información sobre la heterogeneidad celular y las poblaciones celulares raras, pero pierde el contexto espacial.
La transcriptómica espacial preserva la ubicación de la expresión génica dentro de los tejidos, revelando las interacciones celulares y la arquitectura del tejido, aunque debe señalarse que esta técnica requiere un análisis computacional sofisticado. Juntos, estos enfoques ofrecen visiones complementarias de la regulación génica, cada uno adecuado para diferentes preguntas de investigación.
Una de las primeras técnicas de transcriptómica espacial fue la FISH ( in situ hibridación fluorescente), que visualiza directamente las moléculas de ARN dentro de células y tejidos intactos. Funciona mediante el diseño de sondas cortas de ADN o ARN marcadas fluorescentemente que son complementarias a la secuencia de ARN objetivo. Estas sondas se hibridan al ARN objetivo en la muestra, y las ubicaciones de las señales fluorescentes se detectan mediante microscopía de fluorescencia.
Técnicas como FISH de molécula única (smFISH) mejoraron la sensibilidad, permitiendo la detección y cuantificación de transcritos de ARN individuales como puntos limitados por difracción. Las aplicaciones iniciales de FISH solo podían visualizar la distribución espacial de un pequeño número de ARNm bien caracterizados, debido a la superposición espectral de los fluoróforos. Estas primeras técnicas también consumían mucho tiempo y requerían mucha mano de obra, especialmente al analizar grandes secciones de tejido o muchos objetivos. Debido a estas limitaciones, los investigadores desarrollaron métodos modernos con mayor eficiencia.
Los avances tecnológicos mejoran la resolución y el análisis
Las tecnologías de transcriptómica espacial pueden dividirse en cuatro categorías: métodos de microdisección, in situ métodos de hibridación (ISH), in situ métodos de secuenciación (ISS), y in situ métodos de captura (ISC) (ver Figura 3). La elección de la tecnología a menudo depende de objetivos de investigación específicos, como la necesidad de una alta resolución, una amplia cobertura genética o un análisis dirigido. Como vimos en las cifras de publicaciones en la CAS Content Collection, este campo ha experimentado una rápida evolución tecnológica en la última década. Estos avances permiten a los investigadores identificar información crítica sobre los mecanismos de las enfermedades y desarrollar posibles estrategias de tratamiento.
Métodos de microdisección por captura láser
Microdisección por captura láser (LMD) proporciona un medio físico para aislar poblaciones celulares específicas o regiones de interés directamente de secciones de tejido bajo visualización microscópica. Una vez que las áreas deseadas son microdiseccionadas, el ARN se extrae de estas células aisladas o fragmentos de tejido, y luego se analiza utilizando la secuenciación de ARN (RNA-seq) masiva tradicional. Este enfoque vincula los perfiles de expresión génica con ubicaciones espaciales específicas definidas por la microdisección.
Aunque la LMD se centra en el aislamiento espacial en lugar del in situ análisis, su integración con tecnologías avanzadas de RNA-seq ha mejorado significativamente su utilidad en la transcriptómica espacial. Las mejoras en la extracción de ARN a partir de un pequeño número de células, los métodos de amplificación y la profundidad de secuenciación han permitido un análisis del transcriptoma más completo de las muestras microdiseccionadas. Los instrumentos de LMD más recientes ofrecen mayor precisión y automatización, haciendo que el proceso sea más eficiente. Estos pueden resultar cruciales para comprender la heterogeneidad molecular dentro de las muestras de tejido, identificar poblaciones celulares específicas que impulsan la enfermedad y, potencialmente, guiar terapias dirigidas.
Métodos de ISH
La ISH abarca muchas técnicas que utilizan sondas marcadas para detectar secuencias de ácido nucleico específicas (tanto ADN como ARN) dentro de células o tejidos, preservando su contexto espacial. Al igual que la FISH, la ISH se basa en la hibridación de sondas marcadas con secuencias objetivo. Sin embargo, la ISH puede emplear varios métodos de detección más allá de la fluorescencia, incluidos marcadores enzimáticos o radiactivos, que pueden visualizarse mediante microscopía o autorradiografía.
La ISH tradicional que utiliza detección cromogénica (por ejemplo, mediante enzimas que producen un precipitado coloreado) ha sido una técnica fundamental en biología del desarrollo e histología durante décadas, permitiendo la visualización de patrones de expresión génica con resolución celular. La ISH radiactiva ofrece una mayor sensibilidad para transcritos de baja abundancia. La FISH es comparable a un subconjunto de ISH basado en fluorescencia.
La evolución de la ISH se ha centrado en gran medida en aumentar la sensibilidad, la capacidad de multiplexación y la resolución. La FISH multiplexada reciente, como MERFISH, seqFISH, y otras variantes permiten la detección simultánea de cientos a miles de ARNm dentro de la misma muestra mediante el empleo de marcado combinatorio y rondas secuenciales de hibridación e imagen.
Métodos ISS
Estos métodos suelen implicar la conversión de ARN en ADN complementario (ADNc) dentro de la sección de tejido, seguido de in situ amplificación y secuenciación utilizando diversas estrategias de codificación. La información de la secuencia se decodifica mediante rondas iterativas de hibridación, ligación o reacciones enzimáticas, junto con imágenes de alta resolución. Los datos resultantes proporcionan la identidad y la ubicación espacial de numerosos transcritos de ARN con resolución subcelular.
Ejemplos de tecnologías ISS incluyen Single-cell TOtal RNA Miniaturized sequencing (STORM-seq), secuenciación fluorescente in situ (FISSEQ) y padlock métodos de secuenciación basados en sondas. Estas técnicas pueden lograr una alta multiplexación, permitiendo la detección simultánea de miles de especies de ARN dentro de células individuales en su contexto espacial nativo.
Métodos ISC
Los métodos ISC implican colocar oligonucleótidos con códigos de barras espaciales en una sección de tejido para capturar el ARNm liberado de las células. La información espacial está codificada en los códigos de barras únicos de las sondas de captura. Tras la captura del ARNm y la transcripción inversa, el ADNc resultante se agrupa y se secuencia utilizando secuenciación de próxima generación estándar. Al decodificar los códigos de barras espaciales asociados con cada molécula de ADNc, el perfil de expresión génica puede mapearse de nuevo a su ubicación original en el tejido.
Tabla 1: Comparación entre diferentes tecnologías ST
La tecnología original de transcriptómica espacial, desarrollada en el Instituto Karolinska, es un ejemplo destacado de un método ISC, que posteriormente se comercializó como la plataforma Visium de 10x Genomics. Utiliza micromatrices con códigos de barras espaciales para capturar ARNm. Las innovaciones posteriores incluyen Slide-seq, que utiliza perlas con códigos de barras de ADN depositadas en un portaobjetos.
Los métodos ISC iniciales tenían una resolución espacial relativamente baja, limitada por el tamaño de los puntos o perlas de captura. Se han logrado avances significativos en el aumento de la densidad de los códigos de barras espaciales, la reducción del área de captura y la mejora de la eficiencia de la captura de ARNm y la síntesis de ADNc. Técnicas como la transcriptómica espacial de alta definición (HDST) y Slide-seqV2 han aumentado drásticamente la resolución, acercándose a niveles de célula única en algunos casos.
Los métodos ISC ofrecen un enfoque escalable y relativamente rentable para el perfilado espacial de todo el transcriptoma, lo que los hace atractivos para estudios a gran escala en investigación básica, desarrollo de fármacos y, potencialmente, diagnósticos clínicos. La capacidad de analizar el transcriptoma completo con contexto espacial proporciona una visión integral de la organización y función de los tejidos.
La transcriptómica espacial mejora nuestra comprensión de la biología de las enfermedades y el descubrimiento de fármacos
Comprender el contexto espacial de la expresión génica proporciona información crítica para desentrañar los mecanismos de las enfermedades. También afecta al descubrimiento y desarrollo de fármacos. Las cuatro áreas de enfoque de la transcriptómica espacial hoy en día son el cáncer, la neurociencia, la biología del desarrollo y las enfermedades infecciosas.
Cáncer
Uno de los desafíos más importantes en la investigación del cáncer ha sido comprender y abordar la heterogeneidad tumoral y la compleja interacción entre los tumores y su microambiente circundante (TME). El TME es una entidad compleja y en continua evolución que normalmente incluye células inmunitarias, células estromales, vasos sanguíneos y una matriz extracelular. Gracias a los avances en la transcriptómica espacial, ahora se comprende mejor el papel vital del microambiente inmunitario, revelando los diversos mecanismos que utilizan las células cancerosas para eludir el sistema inmunitario del huésped.
Actualmente se acepta ampliamente que el TME es un promotor activo de la progresión del cáncer y no solo una entidad neutral. Regula directa o indirectamente el crecimiento, la metástasis, la resistencia o la susceptibilidad del cáncer a diversos tratamientos. Dado que las técnicas de transcriptómica espacial preservan el contexto espacial, son herramientas excelentes para estudiar las interacciones entre el tumor, el microambiente tumoral (TME) y las células inmunitarias, además de proporcionar nuevos conocimientos para nuestra comprensión de la biología tumoral.
Recientemente se han realizado numerosos estudios notables. Por ejemplo, en el glioblastoma, las células mieloides que liberan IL-10 (ubicadas en regiones tumorales de tipo mesenquimatoso) demostraron promover el agotamiento de las células T, contribuyendo a un TME inmunosupresor. En el carcinoma de células escamosas oral, se identificaron y caracterizaron arquitecturas distintas y conservadas del núcleo y el borde del tumor, las cuales permitieron predecir la supervivencia y la respuesta a terapias dirigidas. La transcriptómica espacial también se utiliza ampliamente en la investigación del cáncer de mama para estudiar la heterogeneidad tumoral y la respuesta a los fármacos impulsada por el TME.
Neurociencia
La notable complejidad funcional del cerebro surge de la disposición espacial precisa y las conexiones entre las diversas poblaciones de células neuronales y gliales. La transcriptómica espacial tiene la capacidad de analizar esta organización a nivel celular y proporcionar información sobre cómo se forman y se vuelven funcionales los circuitos neuronales, cómo se especifican las diferentes regiones cerebrales y cómo las alteraciones de esta arquitectura finamente ajustada pueden conducir al inicio y/o la progresión de diversos trastornos neurológicos.
Actualmente, la transcriptómica espacial se utiliza para descifrar mecanismos críticos y actores moleculares en la patología de las placas amiloides, un sello distintivo del Alzheimer. En modelos de ratón, los científicos han identificado redes de coexpresión génica involucradas en la fase temprana frente a la fase tardía de la enfermedad (genes de mielina y oligodendrocitos [OLIG] y genes inducidos por placas [PIG], respectivamente). En otro estudio, se identificaron asociaciones entre los perfiles de expresión génica regional y la vulnerabilidad regional selectiva a las patologías de amiloide-beta y tau en pacientes con Alzheimer.
La transcriptómica espacial también nos ha ayudado a descubrir posibles dianas moleculares que podrían mejorar las inmunoterapias dirigidas contra el amiloide beta. Los investigadores están estudiando los mecanismos neuroinmunitarios involucrados en la eliminación de placas de amiloide-beta en pacientes que recibieron inmunización activa o pasiva (regulación al alza de genes asociados con el eje TREM2-APOE). Además, un nuevo marco computacional para integrar datos de transcriptómica espacial mediante autoencoders basados en grafos sobreparametrizados con datos de imágenes de cromatina (STACI) se utilizó para identificar posibles nuevos biomarcadores del alzhéimer.
Además de la investigación sobre el alzhéimer, la transcriptómica espacial ha proporcionado nuevos conocimientos sobre varios genes de riesgo y desregulaciones de vías en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
Biología del desarrollo
Varios estudios han destacado el potencial de la transcriptómica espacial en la biología del desarrollo. Al aplicar el método Stereo-seq para generar el atlas transcriptómico espaciotemporal de la organogénesis del ratón (MOSTA), los investigadores han obtenido información valiosa sobre la base molecular de la heterogeneidad celular espacial y la especificación del destino celular en tejidos en desarrollo, como el mesencéfalo dorsal. En otro estudio, se utilizó la transcriptómica espacial para perfilar los patrones de expresión génica espaciotemporal en la cardiogénesis humana y mapear la distribución de los tipos celulares y la organización espacial en el corazón embrionario humano.
En otro avance, se generó un atlas transcriptómico completo del cerebro de ratón con información espacial para 308 grupos celulares con resolución de célula única, lo que abarca más de 4 millones de células. Esto constituye un recurso valioso para estudiar el desarrollo, la función y la regulación génica del cerebro de ratón.
Enfermedades infecciosas
La transcriptómica espacial está transformando el estudio de las enfermedades infecciosas al ofrecer la capacidad de analizar las complejas interacciones entre el huésped y el patógeno dentro del contexto espacial de los tejidos infectados. Esta metodología se ha empleado con éxito para estudiar infecciones bacterianas como Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, y Echinococcus multilocularis. También se utiliza en la investigación de infecciones virales, como SARS-COV-2 y VIH. Los investigadores han identificado directamente ciertos patrones de co-localización de transcritos del huésped y del patógeno, y han descubierto factores del huésped que modulan la respuesta inmunitaria.
Desafíos y oportunidades en transcriptómica espacial
Aunque los enfoques de transcriptómica espacial ofrecen percepciones excepcionales, también conllevan ciertos desafíos. Los datos generados por la mayoría de los métodos de transcriptómica espacial son enormes, complejos y, a veces, ruidosos debido a la baja eficiencia de captura de ARN, los sesgos de amplificación por PCR o los errores de secuenciación. Esto a menudo requiere algoritmos sofisticados para el procesamiento de imágenes, el mapeo espacial y la integración con la secuenciación de ARN de célula única. La fijación, el corte y la tinción de tejidos pueden introducir artefactos que afectan la integridad del ARN y la resolución espacial. Las técnicas de manipulación y procesamiento deben optimizarse para minimizar estos problemas.
Los reactivos, la secuenciación y la infraestructura computacional necesarios para la transcriptómica espacial pueden ser costosos, lo que limita la disponibilidad de estas innovaciones. Además, estos enfoques implican flujos de trabajo experimentales complejos, que requieren investigadores con experiencia en biología molecular, bioinformática y microscopía. Las habilidades interdisciplinarias son esenciales para un análisis y una interpretación precisos. Además, los protocolos de transcriptómica espacial varían considerablemente entre laboratorios, lo que dificulta la comparación de resultados entre estudios.
A pesar de estos desafíos, el campo de la transcriptómica espacial sigue evolucionando rápidamente, con esfuerzos continuos centrados en mejorar la resolución espacial, aumentar la sensibilidad y mejorar el rendimiento. Otra posibilidad es la integración con otros datos ómicos, conocida como multiómica espacial, que podría proporcionar una comprensión más completa de los procesos biológicos y patológicos al combinar genómica, proteómica, epigenómica y metabolómica, todo dentro de un marco espacial.
Los avances continuos están mejorando los métodos de análisis de datos y reduciendo el ruido para una mejor comprensión de los datos de ST. Al igual que muchos otros campos biomédicos, la inteligencia artificial está destinada a revolucionar la transcriptómica espacial al hacer que el análisis de datos sea más eficiente y revelador. Algunos ejemplos recientes incluyen Path2space, un modelo de aprendizaje profundo diseñado para predecir la expresión génica espacial directamente a partir de portaobjetos de histopatología de biopsias de cáncer de mama y predecir la respuesta de los pacientes a la quimioterapia y al trastuzumab, y Spotiphy, un enfoque basado en aprendizaje automático para lograr una resolución de célula única y una cobertura del genoma completo. Las metodologías de transcriptómica espacial in vivo aún se encuentran en sus primeras etapas, pero pronto serán alcanzables gracias a los esfuerzos de investigación en curso.
De cara al futuro, el porvenir de la transcriptómica espacial es prometedor. Está preparado para impulsar más descubrimientos innovadores en la investigación básica y tener un impacto creciente en la medicina traslacional.
