Os Jogos Olímpicos de Verão revelam histórias incríveis de triunfo, determinação e feitos atléticos. Embora os atletas sempre busquem uma vantagem dentro das regras (desde dietas a câmaras hiperbáricas e crioterapia), as substâncias que melhoram o desempenho (PEDs) são uma linha que não deve ser cruzada. Essas substâncias são constantemente examinadas, rastreadas e testadas pelo Comitê Olímpico Internacional, Agência Antidoping dos EUA e Agência Mundial Antidoping. Embora as drogas e metodologias tenham evoluído, os esteroides anabolizantes androgênicos (EAA) continuam sendo os principais potencializadores de desempenho, desde as Olimpíadas até o Tour de France, Ironman Triathlons e até esportes mais específicos como os CrossFit Games. Este blog fornecerá detalhes sobre algumas substâncias comuns que melhoram o desempenho e medidas para detectá-las.
O que são substâncias que melhoram o desempenho?
Uma compreensão estrutural dos esteroides, seus metabólitos e da testosterona é fundamental para o desenvolvimento de protocolos analíticos para sua detecção. A testosterona (T) é um hormônio produzido naturalmente e o ligante nativo do receptor de andrógeno. Quando esse receptor se liga a um andrógeno, como a testosterona ou um esteroide sintético, ele é ativado, resultando em efeitos desejáveis de melhoria de desempenho, incluindo aumento da força muscular, densidade óssea e produção de glóbulos vermelhos. Embora músculos e ossos mais fortes sejam uma vantagem óbvia para um atleta, o aumento da produção de glóbulos vermelhos fornece mais oxigênio aos músculos e órgãos, o que impulsiona a produção de energia e a recuperação. A testosterona (tanto sintética quanto natural), portanto, é a base para os esteroides anabolizantes.
Os esteroides anabolizantes dividem-se principalmente em três categorias (Figura 1 abaixo):
- Derivados da testosterona
- Derivados da 5α-di-hidrotestosterona (DHT)
- Derivados da 19-nortestosterona
Figura 1: A estrutura da testosterona em comparação com derivados comuns de testosterona anabolizante-androgênica, derivados de 5α-di-hidrotestosterona e derivados de 19-nortestosterona.
As diferenças na estrutura, atividades de substrato e meia-vida afetam os perfis biológicos desses derivados de testosterona anabolizante-androgênica. Essas diferenças são a base para o projeto de métodos de detecção desses compostos, especialmente porque todos nós possuímos testosterona naturalmente.
Como as substâncias que melhoram o desempenho são detectadas?
Para cada substância, identificar seus principais metabólitos é o primeiro passo no desenvolvimento de um teste diagnóstico direto de urina, sangue ou saliva. O corpo humano produz testosterona (T) e epitestosterona (E) naturais (endógenas) em uma proporção de aproximadamente 0,4-2 (Figura 2A)1. Um dos primeiros métodos de detecção media simplesmente a proporção de testosterona e epitestosterona em amostras de urina. Se a proporção T/E exceder 4, suspeita-se de doping com um produto de testosterona exógena. Para confirmar a presença de T exógena, o laboratório pode medir a proporção isotópica de 13C:12C na T, já que a T produzida em laboratório tem uma proporção de 13C:12C ligeiramente menor do que a T endógena2. Essa metodologia foi usada na acusação de Floyd Landis em relação ao seu desempenho no Tour de France de 2006, provando que ele havia, de fato, usado testosterona exógena.
Figura 2. Parâmetros de teste para detecção de esteroides anabolizantes androgênicos. A: Estruturas da testosterona (T) e epitestosterona (E), que são produzidas em uma proporção entre 0,4-2 no corpo humano. Valores de T/E acima de 4 são considerados evidência de doping por EAA. B: Metabolismo e procedimentos analíticos necessários para a detecção de estanozolol por urinálise.
Quando uma droga esteroide aparece pela primeira vez no cenário competitivo, cabe aos reguladores entender suas propriedades e metabolismo para sua detecção e análise. Foi o caso nos Jogos Olímpicos de Seul de 1988, quando o velocista Ben Johnson estabeleceu um recorde mundial nos 100m rasos, mas foi destituído de sua medalha de ouro após testar positivo para estanozolol. Para desenvolver um método de detecção para essa droga, os pesquisadores tiveram que entender o metabolismo do estanozolol e como ele poderia ser detectado com maior sensibilidade. A principal via de metabolismo do estanozolol é mostrada no caminho vertical da Figura 2B, juntamente com o tratamento de amostra necessário para detectar metabólitos pela consagrada cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS)3. No entanto, o estanozolol produz outro metabólito em quantidades menores chamado 17-epi-estanozolol-N-glicuronídeo, mostrado no caminho horizontal da Figura 2B. Esse metabólito tem vida longa e pode ser detectado 28 dias após a administração! Para detectar o estanozolol a partir desse metabólito, uma combinação complexa de métodos envolvendo ionização por eletrospray (ESI) e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS) foi desenvolvida mais recentemente. Simplificando, essas técnicas criam íons que podem ser separados e identificados por sua massa para caracterizar e identificar os metabólitos presentes.
Por que as substâncias que melhoram o desempenho são um problema contínuo?
Enquanto os cientistas estavam ocupados melhorando as técnicas para detectar os esteroides anabolizantes androgênicos que conheciam no início dos anos 2000, Barry Bonds estava ocupado rebatendo home runs. A MLB mal sabia que, nos bastidores, Bonds e outros atletas vinham usando um esteroide recém-sintetizado, a tetrahidrogestrinona (THG), projetada especificamente para efeitos anabólicos potentes e com protocolos de teste antidoping em mente. Apelidada de "The Clear", a THG não pôde ser detectada na urina inicialmente porque o programa antidoping não tinha conhecimento de sua existência ou metabólitos. Durante uma investigação, uma amostra de THG foi extraída do resíduo de uma seringa usada e identificada, após o que um método de LC-MS/MS pôde ser facilmente desenvolvido para triagem4.
O escândalo do beisebol tipifica algumas das questões que envolvem a detecção direta de EAA em programas antidoping. Primeiro, o processo de triagem procura metabólitos conhecidos de substâncias conhecidas; uma organização bem equipada pode, portanto, sintetizar "esteroides de design" que ainda não foram vistos para evitar a detecção. Mesmo quando um protocolo de teste está em vigor, testes pouco frequentes (como na MLB, onde os testes ocorrem duas vezes por ano) podem permitir que o uso de esteroides passe despercebido; períodos mais longos entre os testes permitem que as concentrações de metabólitos de esteroides diminuam abaixo dos limites de detecção mais facilmente. Também é possível que um atleta utilize agentes mascarantes e diuréticos para evitar a detecção5, o que impõe um ônus adicional às administrações de testes.
As agências antidoping estavam cientes desses problemas e do uso contínuo de substâncias para melhoria de desempenho, apesar de seus esforços para contê-los. Já na década de 1990, pesquisas mostraram que, na ausência de agentes exógenos, as concentrações e proporções de testosterona, seus precursores e seus metabólitos permanecem notavelmente estáveis na urina de um indivíduo, e os esteroides anabólico-androgênicos têm um efeito duradouro sobre esses valores, que seriam estáveis de outra forma. No entanto, foi apenas em 2007 que os pesquisadores adotaram a inferência bayesiana para formalizar a detecção de valores anormais nessas proporções. Essas proporções, juntamente com um perfil hematológico, constituem um Passaporte Biológico do Atleta (ABP). Este passaporte é uma ferramenta de referência poderosa para aprimorar nossa capacidade de detectar substâncias para melhoria de desempenho.
Desenvolvimentos futuros no monitoramento de substâncias para melhoria de desempenho
Os bioensaios in vitro são outra abordagem promissora não direcionada para a detecção de andrógenos. Ao alterar células com proteínas repórteres sob a regulação de elementos de resposta a andrógenos, esses ensaios podem detectar a ativação do receptor de andrógeno, independentemente de sua fonte6. Isso torna os bioensaios úteis para detectar andrógenos em amostras de composição desconhecida, como em suplementos alimentares, que nos últimos anos levaram atletas a ingerir substâncias proibidas inadvertidamente. O desenvolvimento contínuo de métodos de detecção baseados em bioatividade não direcionados provavelmente ajudará os pesquisadores a caracterizar andrógenos emergentes, sejam eles de natureza esteroidal ou parte da classe emergente de moduladores seletivos do receptor de andrógeno, que não apresentam semelhança estrutural com a testosterona e não são tão compreendidos metabolicamente7 (Figura 3).
Figura 3. Estruturas químicas de moduladores seletivos do receptor de andrógeno (SARMs) populares de abuso.
Resumo
Olhando para os Jogos Olímpicos e além, sem dúvida haverá escândalos envolvendo doping por indivíduos, às vezes a mando de suas organizações. Essa é a natureza aparente do esporte de elite. Nos casos em que drogas projetadas são usadas para evitar a detecção, tais compostos, por sua própria natureza, não teriam sido clinicamente testados quanto à segurança e, portanto, representariam um risco à saúde dos atletas. Mas, à medida que as organizações esportivas continuam a ser criativas com a farmacologia que utilizam, a ciência continuará a equipar as autoridades antidoping com o conhecimento e as capacidades analíticas necessárias para detectar substâncias para melhoria de desempenho. Maximizar essas capacidades servirá como um impedimento para minimizar o doping, promover a saúde no esporte e preservar uma aparência de justiça.
Referências
1. Donike, M., Nachweis von exogenem Testosteron. Dt. Ärzte-Verl.: Köln, 1983; p S. 293-298.
2. Polet, M.; Van Eenoo, P., GC-C-IRMS in routine doping control practice: 3 years of drug testing data, quality control and evolution of the method. Anal Bioanal Chem 2015, 407 (15), 4397-409.
3. Schänzer, W.; Opfermann, G.; Donike, M., Metabolism of stanozolol: identification and synthesis of urinary metabolites. J Steroid Biochem 1990, 36 (1-2), 153-74.
4. Catlin, D. H.; Sekera, M. H.; Ahrens, B. D.; Starcevic, B.; Chang, Y. C.; Hatton, C. K., Tetrahydrogestrinone: discovery, synthesis, and detection in urine. Rapid Commun Mass Spectrom 2004, 18 (12), 1245-049.
5. Alquraini, H.; Auchus, R. J., Strategies that athletes use to avoid detection of androgenic-anabolic steroid doping and sanctions. Molecular and Cellular Endocrinology 2018, 464, 28-33.
6. Lund, R. A.; Cooper, E. R.; Wang, H.; Ashley, Z.; Cawley, A. T.; Heather, A. K., Nontargeted detection of designer androgens: Underestimated role of in vitro bioassays. Drug Testing and Analysis 2021, 13 (5), 894-902.
7.Thevis, M.; Schänzer, W., Detection of SARMs in doping control analysis. Molecular and Cellular Endocrinology 2018, 464, 34-45.
