夏季奥运会展现了许多关于胜利、决心和运动壮举的动人故事。虽然运动员总是在规则允许的范围内寻求提升表现的方法（从饮食到高压氧舱，再到冷冻疗法），但使用兴奋剂（PEDs）是绝对不可逾越的红线。兴奋剂始终受到国际奥委会、美国反兴奋剂机构和世界反兴奋剂机构的严格审查、追踪和检测。尽管药物和检测手段不断演变，但合成代谢类固醇（AAS）依然是贯穿从奥运会到环法自行车赛、铁人三项，甚至包括CrossFit运动会等小众赛事在内的各类运动中的主要违禁药物。本博客将详细介绍一些常见的兴奋剂及其检测措施。
什么是兴奋剂？
对类固醇、其代谢产物及睾酮结构的理解，是开发检测分析方案的核心。睾酮（T）是一种天然产生的激素，也是雄激素受体的天然配体。当该受体与睾酮或合成类固醇等雄激素结合时，会被激活，从而产生理想的增强表现效果，包括增加肌肉力量、骨密度和红细胞生成。虽然更强壮的肌肉和骨骼对运动员来说是显而易见的优势，但红细胞生成的增加能为肌肉和器官提供更多氧气，从而促进能量产生和身体恢复。因此，睾酮（无论是合成的还是天然的）是合成代谢类固醇的基础。
合成代谢类固醇主要分为三类（见下图1）：
- 睾酮衍生物
- 5α-二氢睾酮（DHT）衍生物
- 19-去甲睾酮衍生物
图1：睾酮与常见的合成代谢雄激素类睾酮衍生物、5α-二氢睾酮衍生物及19-去甲睾酮衍生物的结构对比。
结构、底物活性和半衰期的差异影响了这些合成代谢雄激素类睾酮衍生物的生物学特性。这些差异是设计检测方法的基础，尤其是考虑到我们体内本身就存在天然睾酮。
如何检测兴奋剂？
对于每种药物，识别其主要代谢产物是开发直接尿液、血液或唾液诊断测试的第一步。人体产生的天然（内源性）睾酮（T）与表睾酮（E）的比例约为0.4-2（图2A）1。最早的检测方法之一仅是测量尿液样本中睾酮与表睾酮的比例。如果T/E比值超过4，则怀疑使用了外源性睾酮产品。为了确认外源性T的存在，实验室可以测量T中13C:12C的同位素比值，因为实验室合成的T其13C:12C比值略低于内源性T2。这一方法曾用于弗洛伊德·兰迪斯（Floyd Landis）在2006年环法自行车赛表现的调查中，证实他确实使用了外源性睾酮。
图2。合成代谢雄激素类固醇的检测参数。A：睾酮（T）和表睾酮（E）的结构，人体内两者的比例在0.4-2之间。T/E值超过4被视为AAS兴奋剂违规的证据。B：通过尿检检测司坦唑醇所需的代谢和分析程序。
当一种类固醇药物首次出现在竞技赛场时，监管机构有责任了解其特性和代谢过程，以便进行检测和分析。1988年汉城奥运会就是如此，短跑运动员本·约翰逊（Ben Johnson）在100米短跑中打破世界纪录，但因司坦唑醇检测呈阳性而被剥夺金牌。为了开发该药物的检测方法，研究人员必须了解司坦唑醇的代谢过程以及如何最灵敏地检测到它。司坦唑醇的主要代谢途径如图2B的垂直路径所示，以及通过久经考验的气相色谱-质谱联用（GC-MS）检测代谢产物所需的样本处理方法3。然而，司坦唑醇会产生少量另一种代谢产物，称为17-表-司坦唑醇-N-葡萄糖苷酸，如图2B的水平路径所示。这种代谢产物寿命较长，在用药28天后仍可被检测到！为了通过该代谢产物检测司坦唑醇，最近开发了一种结合电喷雾电离（ESI）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）的复杂方法。简而言之，这些技术产生离子，通过质荷比进行分离和识别，从而表征并鉴定存在的代谢产物。
为什么兴奋剂问题屡禁不止？
当科学家们在21世纪初忙于改进已知合成代谢类固醇的检测技术时，巴里·邦兹（Barry Bonds）正忙于打出全垒打。美国职业棒球大联盟（MLB）当时并不知道，在幕后，邦兹和其他运动员一直在使用一种新合成的类固醇——四氢孕三烯酮（THG），这种药物专为强效合成代谢效果而设计，且在开发时就考虑到了反兴奋剂检测方案。THG被称为“透明（The Clear）”，最初无法在尿液中检测出来，因为反兴奋剂机构对其存在或代谢产物一无所知。在一次调查中，研究人员从一个用过的注射器残留物中提取了THG样本并将其识别出来，此后，LC-MS/MS筛选方法便可轻松开发出来4。
这起棒球丑闻典型地反映了反兴奋剂项目中直接检测AAS所面临的一些问题。首先，筛选过程是在寻找已知物质的已知代谢产物；因此，设备齐全的组织完全可以合成尚未被发现的“设计类固醇”以规避检测。即使制定了检测方案，检测频率过低（例如MLB每年仅检测两次）也可能导致类固醇使用未被发现；两次检测之间的间隔越长，类固醇代谢产物的浓度就越容易降至检测限以下。此外，运动员还可以使用掩蔽剂和利尿剂来逃避检测5，这给检测管理部门带来了额外的负担。
反兴奋剂机构早已意识到这些问题，也深知尽管他们竭力遏制，但违禁药物的使用依然屡禁不止。早在 20 世纪 90 年代，研究就已表明，在没有外源性药物干预的情况下，人体尿液中睾酮及其前体和代谢物的浓度与比例 保持着惊人的稳定性，而合成代谢雄激素类固醇会对这些原本稳定的数值产生持久影响。然而，直到 2007 年，研究人员才采用 贝叶斯推理 将这些比例异常值的检测正式规范化。这些比例数据与血液学指标共同构成了 运动员生物护照 (ABP)。该护照是一项强大的基准工具，能够显著提升我们检测违禁药物的能力。
违禁药物监测的未来发展
体外生物测定法是另一种用于检测雄激素的有前景的非靶向方法。通过利用受雄激素反应元件调节的报告蛋白对细胞进行改造，这些测定法可以检测雄激素受体的激活情况，而无需考虑其来源6。这使得生物测定法在检测成分不明的样本（例如膳食补充剂）时非常有效，近年来，运动员正是因误服此类产品而导致违禁物质检测呈阳性。非靶向生物活性检测方法的进一步发展，将有助于研究人员鉴定新兴的雄激素，无论是类固醇类物质，还是结构上与睾酮完全不同且代谢机制尚不明确的新型选择性雄激素受体调节剂7（图 3）。
图 3。常见的滥用选择性雄激素受体调节剂 (SARM) 的化学结构。
总结
展望奥运会及未来，涉及个人甚至在组织授意下进行兴奋剂违规的丑闻无疑仍将出现。这似乎是精英体育的固有属性。在利用新型药物规避检测的情况下，这些化合物本身未经临床安全性测试，必然会对运动员的健康构成风险。但随着体育组织不断在药理学手段上推陈出新，科学界也将持续为反兴奋剂机构提供所需的知识与分析能力，以检测违禁药物。最大限度地发挥这些能力，将起到威慑作用，从而减少兴奋剂使用，促进体育健康，并维护公平竞争的原则。
参考文献
1. Donike, M., Nachweis von exogenem Testosteron. Dt. Ärzte-Verl.: Köln, 1983; p S. 293-298.
2. Polet, M.; Van Eenoo, P., GC-C-IRMS in routine doping control practice: 3 years of drug testing data, quality control and evolution of the method. Anal Bioanal Chem 2015, 407 (15), 4397-409.
3. Schänzer, W.; Opfermann, G.; Donike, M., Metabolism of stanozolol: identification and synthesis of urinary metabolites. J Steroid Biochem 1990, 36 (1-2), 153-74.
4. Catlin, D. H.; Sekera, M. H.; Ahrens, B. D.; Starcevic, B.; Chang, Y. C.; Hatton, C. K., Tetrahydrogestrinone: discovery, synthesis, and detection in urine. Rapid Commun Mass Spectrom 2004, 18 (12), 1245-049.
5. Alquraini, H.; Auchus, R. J., Strategies that athletes use to avoid detection of androgenic-anabolic steroid doping and sanctions. Molecular and Cellular Endocrinology 2018, 464, 28-33.
6. Lund, R. A.; Cooper, E. R.; Wang, H.; Ashley, Z.; Cawley, A. T.; Heather, A. K., Nontargeted detection of designer androgens: Underestimated role of in vitro bioassays. Drug Testing and Analysis 2021, 13 (5), 894-902.
7.Thevis, M.; Schänzer, W., Detection of SARMs in doping control analysis. Molecular and Cellular Endocrinology 2018, 464, 34-45.
