A produção de plásticos baratos, duráveis e adaptáveis explodiu nas últimas décadas à medida que eles se infiltram em todas as partes de nossas vidas; mas esse polímero, antes desejável, tem um lado sombrio. Os plásticos podem levar centenas de anos para se degradar e, com a produção em níveis astronômicos (globalmente, mais de 350 milhões de toneladas por ano), a poluição plástica é uma das preocupações ambientais mais urgentes que o mundo enfrenta hoje.
Impressionantes 150 milhões de toneladas de plástico acabam em aterros sanitários ou são liberadas no meio ambiente anualmente, e mais de 8 milhões de toneladas são transportadas pelos rios para os oceanos do mundo. A maior parte disso não se degrada, mas simplesmente se decompõe em micropartículas. Esses microplásticos bem documentados são encontrados na água do oceano, dentro de animais marinhos e até mesmo profundamente dentro dos sistemas gastroentéricos humanos. A poluição plástica é uma das questões ambientais mais críticas que a humanidade enfrenta hoje, e os pesquisadores têm se dedicado a buscar respostas para esse problema desconcertante do plástico.
Despolimerização: Resolvendo o enigma da reciclagem de polímeros
Os plásticos são feitos de polímeros – longas cadeias criadas pela repetição de blocos de monômeros. A maioria dos plásticos amplamente utilizados são termoplásticos ou termofixos. Os termoplásticos, como acrílico, poliamida e polietileno, tornam-se macios e moldáveis em altas temperaturas e endurecem quando resfriados. Essa propriedade os torna relativamente fáceis de reciclar, pois podem ser amolecidos e remoldados em novos produtos, embora a queda na qualidade limite o benefício. Os plásticos termofixos, como poliuretano, resina epóxi e resina melamínica, endurecem quando aquecidos e são quase impossíveis de reciclar. Os desafios enfrentados na reciclagem de termoplásticos e termofixos significam que todos os plásticos acabarão por contribuir para a contaminação ambiental.
Para alcançar uma reciclagem real, com subsequente reutilização em novos produtos, os resíduos plásticos precisam ser devolvidos aos seus monômeros originais por meio de um processo chamado despolimerização. Este é um avanço técnico crítico necessário para permitir uma economia circular global de materiais. Em sistemas biológicos, a despolimerização completa em monômeros pode ser necessária para a absorção e o crescimento microbiano.
Para alcançar a despolimerização, os cientistas voltaram-se para a natureza, buscando enzimas microbianas que possam decompor plásticos. Em 2012, pesquisadores da Universidade de Osaka descobriram uma enzima em uma pilha de compostagem que pode decompor um dos plásticos mais usados no mundo: polietileno tereftalato (PET, Número de Registro CAS 25038-59-9, fórmula (C10H8O4)n).
A enzima, conhecida como cutinase de composto de folha e galho (LLC), quebra as ligações entre os monômeros de PET, mas é intolerante à temperatura de amolecimento de 65°C do PET, desnaturando após alguns dias de trabalho nessa temperatura e limitando sua praticidade industrial. Como a despolimerização só pode ocorrer em plástico fundido, as enzimas devem ser estáveis em temperaturas elevadas
Despolimerização de PET de ação dupla a partir de uma bactéria do solo pouco conhecida
O PET é um termoplástico e um dos poliésteres mais utilizados. A produção mundial de PET cresceu de 42 milhões de toneladas em 2014 para 50 milhões de toneladas em 2016 e deve atingir 87 milhões de toneladas até 2022.
Este polímero sintético é fabricado a partir de ácido tereftálico derivado de petróleo (TPA) e etilenoglicol (EG). O PET é um polímero versátil que pode ser feito transparente, opaco ou de cor branca, dependendo de sua estrutura cristalina e tamanho de partícula (Fig. 1). É amplamente utilizado para produzir fibras de vestuário e recipientes, incluindo garrafas de água, e o PET não orientado pode ser termoformado (ou moldado) para fabricar outros produtos de embalagem, como embalagens blister1. Encontrar uma maneira eficaz de despolimerizar o PET será um marco importante na jornada em direção à verdadeira reciclagem de plástico e à consequente proteção ambiental.
A biodegradação do PET tem sido extensivamente estudada porque as enzimas esterases (enzimas que dividem ésteres em um ácido e um álcool) são abundantes na natureza2. Relatos sobre a degradação biológica do PET ou sua utilização para apoiar o crescimento microbiano são, no entanto, pouco frequentes. Alguns organismos do grupo dos fungos filamentosos, Fusarium oxysporum e Fusarium solani, foram cultivados em um meio mineral contendo fios de PET3.
Em 2016, Yoshida et al4 relataram a descoberta e caracterização da cepa de bactéria do solo, Ideonella sakaiensis 201-F6, encontrada crescendo em sedimentos contaminados com PET perto de uma instalação de reciclagem de plástico no Japão. Esta bactéria gram-negativa, aeróbica e em forma de bastonete tem a notável capacidade de usar o PET como sua principal fonte de carbono e energia para o crescimento.
I. sakaiensis emprega um sistema de duas enzimas para despolimerizar o PET em seus blocos de construção, TPA e EG, que são posteriormente catabolizados em uma fonte de carbono e energia. Uma das duas enzimas, a proteína ISF6_4831, hidrolisa e quebra as ligações éster. Com preferência por ésteres aromáticos em vez de alifáticos, e uma inclinação específica para o PET, ela é designada como uma PET hidrolase (PETase). A enzima PETase em I. sakaiensis é uma serina hidrolase semelhante à cutinase que ataca o polímero PET, liberando bis(2-hidroxietil) tereftalato (BHET), mono(2-hidroxietil) tereftalato (MHET) e TPA. A PETase cliva ainda mais o BHET em MHET e EG. A segunda enzima, a proteína ISF6_0224, MHET hidrolase (MHETase), hidrolisa ainda mais o MHET solúvel para produzir TPA e EG (Fig. 2). Ambas as enzimas são necessárias, provavelmente de forma sinérgica, para converter enzimaticamente o PET em seus dois monômeros ambientalmente benignos, TPA e EG4, tornando possível reciclar totalmente o PET.
PETase mutant’s supersize PET degradation capability
Sequence and structural studies of PETase enzyme highlight similarities to cutinase enzymes, evolved by many bacteria to break down cutin, a natural, waxy polymer that forms part of the protective cuticle in many plants. Crystal structural analysis and biochemical tests reveal that the PETase in I.sakaiensis 2 has an open active-site architecture in the binding site and that it likely operates along the canonical serine hydrolase catalytic mechanism5.
Based on structural modifications in PETase and a homologous cutinase active-site cleft, PETase variants have now been produced and tested for PET degradation, including a mutant with a double mutation distal to the catalytic center. This area is hypothesized to be capable of amending important substrate-binding interactions6. This double mutant, based on cutinase architecture, was found to exhibit enhanced PET degradation capacity relative to wild-type PETase6 and a patent has now been filed7.
By narrowing the binding cleft via the mutation of two active-site residues in cutinases, researchers observed improved PET degradation, suggesting that PETase does not exhibit the optimum structure for degradation of crystalline PET, despite evolving in a PET-rich environment. The mutant enzyme takes just a few days to start breaking down the plastic – significantly faster than the centuries it takes in the oceans.
From double mutant to a double enzyme cocktail
When MHETase enzyme is added to the reaction, the enzyme mixture breaks down PET twice as fast as PETase on its own. The degradation trend observed within the tested enzyme loadings range shows increasing levels of constituent monomers as the concentration of both enzymes increases. This indicates that the reactions are enzyme, rather than substrate, limited. The synergy analysis also indicates that degradation rates increase with PETase loading and that the presence of MHETase, even at low concentrations relative to PETase, improves total degradation. The current experiments do not indicate an optimal ratio of PETase to MHETase.
Creating a super-enzyme triples PET degradation
In further experiments exploring the properties and scope of PET degradation, researchers have engineered a new super enzyme by stitching MHETase and PETase into one long chain. The chimeric proteins covalently linking the C terminus of MHETase to the N terminus of PETase, using flexible glycine-serine linkers, were generated and assayed for degradation of amorphous PET (Fig. 3). When comparing the extent of degradation achieved by different enzymes, the chimeric proteins outperform both PETase and MHETase, as well as the unlinked enzyme mixture.
Interestingly, the super-enzyme not only depolymerizes PET but also works on PEF (polyethylene furanoate), a sugar-based bioplastic used in beer bottles.
The enzymatic deconstruction of some natural polymers, such as cellulose and chitin, is achieved in nature by mixtures of synergistically acting enzymes secreted from microbes8. These natural microbial systems have evolved over time to optimally degrade such polymers. It appears that some soil bacteria, such as I. sakaiensis, have evolved in a similar way to utilize a polyester substrate with a two-enzyme system4,9. Unlike natural degradation, which can take centuries, the super-enzyme can convert PET back to its monomers in just a few days, although this is still too slow to be commercially viable.
Endless recycling with plastic degradation
By converting PET back to its original, monomer building blocks, the super-enzyme would allow plastics to be made and reused endlessly, reducing dependence on fossil resources. And the breakthroughs don’t stop here…
In 2020, a major advance saw scientists identifying another enzyme that could degrade PET in just 10 hours10. The research screened a large variety of bacteria and enzymes for potential candidates, including the leaf-branch compost cutinase, LCC, that was first discovered in 2012. Hundreds of mutant PET hydrolase enzymes were then produced by varying amino acids at the binding site and improving thermal stability. Bacterial mutants were then screened to identify efficient PET decomposers. After running this process for multiple rounds, a mutant enzyme was isolated that is 10,000 times more efficient in degrading PET than the native LCC. It is also stable at 72°C, close to the melting temperature of PET. This finding contributes significantly towards attaining the infinite recycling of PET and is already at a pilot industrial stage10.
We are only seeing the tip of the iceberg of possibilities that these microorganisms and their enzymes can offer. Most plastics are derived from fossil fuels, finite in their creation yet ubiquitous in our environment. Plastic pollution will continue to be a growing problem unless we can find a way to form a circular economy. In just a few decades, we will be unable to produce the plastic items on which we depend unless we can find a way to recycle the waste that already exists. Traditional recycling is not effective or sustainable and, unless we can reduce plastics to their monomer constituents on an industrial scale, we cannot hope to solve this problem. Thankfully, with the help of nature, some skillful evolution and a dash of scientific ingenuity, there is a hope that this problem might be solved.
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REFERENCES
(1) Pasbrig, E.; Claessens, P.; Walker, R. I.; Walker, R. Peelable cover film for pharmaceutical packaging, e.g. blister packs, comprises paper, aluminum foil or heat-resistant plastic, a layer of special plastic film, mesh or fabric, a layer of aluminum foil and a heat-sealing layer. EP1767347-A1; WO2007038488-A2; EP1928654-A2; AU2006294788-A1; US2008251411-A1; CN101316702-A; CA2623586-A1; JP2009509874-W; TW200727887-A; MX2008004201-A1; IN200801248-P2; ZA200802826-A; BR200616412-A2; WO2007038488-A3; EP1928654-A4.
(2) Han, X.; Liu, W. D.; Huang, J. W.; Ma, J. T.; Zheng, Y. Y.; Ko, T. P.; Xu, L. M.; Cheng, Y. S.; Chen, C. C.; Guo, R. T., Structural insight into catalytic mechanism of PET hydrolase. Nature Communications 2017, 8. DOI: 10.1038/s41467-017-02255-z
(3) Nimchua, T.; Eveleigh, D. E.; Sangwatanaroj, U.; Punnapayak, H., Triagem de fungos tropicais produtores de enzima hidrolisadora de tereftalato de polietileno para modificação de tecidos. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2008, 35 (8), 843-850. DOI: 10.1007/s10295-008-0356-3
(4) Yoshida, S.; Hiraga, K.; Takehana, T.; Taniguchi, I.; Yamaji, H.; Maeda, Y.; Toyohara, K.; Miyamoto, K.; Kimura, Y.; Oda, K., Uma bactéria que degrada e assimila tereftalato de polietileno. Science 2016, 351 (6278), 1196-1199. DOI: 10.1126/science.aad6359
(5) Rauwerdink, A.; Kazlauskas, R. J., Como a mesma maquinaria catalítica central catalisa 17 reações diferentes: a tríade catalítica serina-histidina-aspartato de enzimas com enovelamento alfa/beta-hidrolase. Acs Catalysis 2015, 5 (10), 6153-6176. DOI: 10.1021/acscatal.5b01539
(6) Austin, H. P.; Allen, M. D.; Donohoe, B. S.; Rorrer, N. A.; Kearns, F. L.; Silveira, R. L.; Pollard, B. C.; Dominick, G.; Duman, R.; El Omari, K.; Mykhaylyk, V.; Wagner, A.; Michener, W. E.; Amore, A.; Skaf, M. S.; Crowley, M. F.; Thorne, A. W.; Johnson, C. W.; Woodcock, H. L.; McGeehan, J. E.; Beckham, G. T., Caracterização e engenharia de uma poliésterase aromática degradadora de plástico. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115 (19), E4350-E4357. DOI: 10.1073/pnas.1718804115
(7) Beckham, G. T.; Johnson, C. W.; Donohoe, B. S.; Rorrer, N.; McGeehan, J. E.; Austin, H. P.; Allen, M. D. Nova enzima modificada de digestão de tereftalato de polietileno compreendendo mutação de aminoácido de um resíduo de sítio ativo, usada para degradar um polímero, por exemplo, poliéster, polímero aromático ou polímero semi-aromático e tereftalato de polietileno. WO2019168811-A1.
(8) Payne, C. M.; Knott, B. C.; Mayes, H. B.; Hansson, H.; Himmel, M. E.; Sandgren, M.; Stahlberg, J.; Beckham, G. T., Celulases fúngicas. Chem. Rev. 2015, 115 (3), 1308-1448. DOI: 10.1021/cr500351c
(9) Taniguchi, I.; Yoshida, S.; Hiraga, K.; Miyamoto, K.; Kimura, Y.; Oda, K., Biodegradação de PET: Status atual e aspectos de aplicação. Acs Catalysis 2019, 9 (5), 4089-4105. DOI: 10.1021/acscatal.8b05171
(10) Tournier, V.; Topham, C. M.; Gilles, A.; David, B.; Folgoas, C.; Moya-Leclair, E.; Kamionka, E.; Desrousseaux, M. L.; Texier, H.; Gavalda, S.; Cot, M.; Guémard, E.; Dalibey, M.; Nomme, J.; Cioci, G.; Barbe, S.; Chateau, M.; André, I.; Duquesne, S.; Marty, A., Uma despolimerase de PET projetada para decompor e reciclar garrafas plásticas. Nature 2020, 580 (7802), 216-219. DOI: 10.1038/s41586-020-2149-4
