安価で耐久性に優れ、用途の広いプラスチックの生産は、ここ数十年の間に爆発的に増加し、私たちの生活のあらゆる場面に浸透しました。しかし、かつては理想的と思われたこのポリマーには、暗い側面があります。プラスチックは分解に数百年かかる場合があり、その生産量は天文学的なレベル（世界全体で年間3億5000万トン以上）に達しており、プラスチック汚染は今日、世界が直面している最も差し迫った環境問題の一つとなっています。
驚くべきことに、年間1億5000万トンのプラスチックが埋め立て地に送られるか、環境中に放出されており、そのうち800万トン以上が河川を通じて世界の海洋に運ばれています。そのほとんどは分解されることなく、単に微粒子へと細分化されます。こうしたマイクロプラスチックの存在は広く確認されており、海水や海洋生物の体内、さらには人間の消化管の深部にまで入り込んでいます。プラスチック汚染は今日、人類が直面している最も深刻な環境問題の一つであり、研究者たちはこの厄介なプラスチック問題の解決策を懸命に模索しています。
解重合：ポリマーリサイクルの難問を解く
プラスチックはポリマー、すなわちモノマーという構成単位が繰り返されてできた長い鎖から成っています。広く使用されているプラスチックのほとんどは、熱可塑性プラスチックか熱硬化性プラスチックのいずれかです。アクリル、ポリアミド、ポリエチレンなどの熱可塑性プラスチックは、高温で柔らかくなって成形しやすく、冷えると硬化します。この特性により、加熱して柔らかくし、新しい製品に再成形できるため、リサイクルが比較的容易ですが、品質の低下が再利用の妨げとなっています。一方、ポリウレタン、エポキシ樹脂、メラミン樹脂などの熱硬化性プラスチックは、加熱すると硬化するため、リサイクルはほぼ不可能です。熱可塑性・熱硬化性双方のリサイクルが抱える課題は、すべてのプラスチックがいずれ環境汚染の原因となる運命にあることを意味しています。
新しい製品への再利用を伴う真のリサイクルを実現するには、廃プラスチックを「解重合」というプロセスを経て、元のモノマーの状態に戻す必要があります。これは、循環型材料経済を世界規模で実現するために不可欠な技術的進歩です。生物学的システムにおいて、モノマーへの完全な解重合は、微生物による取り込みと増殖のために必要となる場合があります。
解重合を実現するため、科学者たちは自然界に目を向け、プラスチックを分解できる微生物酵素を探し求めてきました。2012年、大阪大学の研究チームは、堆肥の中から世界で最も広く使用されているプラスチックの一つを分解できる酵素を発見しました。そのプラスチックとはポリエチレンテレフタレート（PET、CAS登録番号25038-59-9、化学式(C10H8O4)n）です。
この酵素は「リーフ・ブランチ・コンポスト・クチナーゼ（LLC）」として知られ、PETのモノマー間の結合を切断しますが、PETが軟化する温度である65℃には耐性がありません。この温度で数日間作用させると変性してしまうため、産業利用には限界があります。解重合はプラスチックが溶融した状態でしか起こり得ないため、酵素は高温下でも安定している必要があります。
あまり知られていない土壌細菌による二段階のPET解重合
PETは熱可塑性プラスチックであり、最も広く使用されているポリエステルの一つです。世界のPET生産量は、2014年の4200万トンから2016年には5000万トンへと増加し、2022年には8700万トンに達する見込みです。
この合成ポリマーは、石油由来のテレフタル酸（TPA）とエチレングリコール（EG）から製造されます。PETは結晶構造や粒子径に応じて透明、不透明、白色など、さまざまな外観に加工できる汎用性の高いポリマーです（図1）。衣料用繊維や水ボトルなどの容器の製造に広く使用されており、非配向PETは熱成形（または成形）によってブリスターパックなどの他の包装製品を製造することも可能です1。PETを効率的に解重合する方法を見出すことは、真のプラスチックリサイクルと、それに伴う環境保護に向けた重要なマイルストーンとなるでしょう。
PETの生分解については、エステラーゼ（エステルを酸とアルコールに分解する酵素）が自然界に豊富に存在するため、広範に研究されてきました2。しかし、PETの生物学的分解や、それを微生物の増殖に利用する報告は稀です。糸状菌グループの一部であるフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）およびフザリウム・ソラニ（Fusarium solani）は、PET糸を含む無機培地で培養された実績があります3。
2016年、吉田ら4は、日本のプラスチックリサイクル施設近くのPET汚染堆積物から、土壌細菌株イデオネラ・サカイエンシス（Ideonella sakaiensis）201-F6を発見し、その特性を明らかにしました。このグラム陰性の好気性桿菌は、PETを増殖のための主要な炭素源およびエネルギー源として利用するという驚くべき能力を持っています。
I.サカイエンシスは、二つの酵素システムを用いてPETを構成単位であるTPAとEGに解重合し、それらをさらに異化して炭素源およびエネルギー源として利用します。二つの酵素のうちの一つであるISF6_4831タンパク質は、エステル結合を加水分解して切断します。脂肪族エステルよりも芳香族エステルを好み、特にPETに対して高い親和性を持つことから、これはPET加水分解酵素（PETase）と命名されました。I.サカイエンシス内のPETaseは、クチナーゼ様セリン加水分解酵素であり、PETポリマーを攻撃してビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレート（BHET）、モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタレート（MHET）、およびTPAを放出します。PETaseはさらにBHETをMHETとEGに分解します。もう一つの酵素であるISF6_0224タンパク質、すなわちMHET加水分解酵素（MHETase）は、可溶性のMHETをさらに加水分解してTPAとEGを生成します（図2）。両方の酵素が（おそらく相乗的に）作用することで、PETを環境に無害な二つのモノマーであるTPAとEGに酵素的に変換し、PETの完全なリサイクルを可能にしています4。
PETase mutant’s supersize PET degradation capability
PETase酵素の配列および構造解析により、多くの細菌がクチン（多くの植物の保護クチクラ層を構成する天然のワックス状ポリマー）を分解するために進化させたクチナーゼ酵素との類似性が明らかになりました。結晶構造解析および生化学的試験の結果、I. sakaiensis 2のPETaseは、結合部位に開いた活性部位構造を持ち、標準的なセリンヒドロラーゼの触媒メカニズムに従って機能している可能性が高いことが判明しました5。
PETaseおよび相同なクチナーゼの活性部位の構造改変に基づき、PET分解を目的としたPETase変異体が作製・試験されました。その中には、触媒中心から離れた位置に二重変異を持つ変異体も含まれます。この領域は、重要な基質結合相互作用を改善できる可能性があると推測されています6。クチナーゼの構造を基にしたこの二重変異体は、野生型PETaseと比較してPET分解能力が向上していることが確認され6、特許も出願されています7。
クチナーゼの活性部位にある2つの残基を変異させて結合クレフトを狭めることで、PET分解の改善が観察されました。これは、PETaseがPETに富んだ環境で進化したにもかかわらず、結晶性PETの分解に最適な構造を備えていないことを示唆しています。この変異酵素は、プラスチックの分解を開始するまでにわずか数日しかかからず、海洋で数百年かかる分解プロセスを大幅に短縮します。
From double mutant to a double enzyme cocktail
反応にMHETase酵素を加えると、酵素混合物はPETase単独の場合の2倍の速さでPETを分解します。試験した酵素添加量の範囲内で観察された分解傾向は、両酵素の濃度が高まるにつれて構成モノマーの量が増加することを示しています。これは、反応が基質ではなく酵素によって制限されていることを意味します。相乗効果の分析からも、PETaseの添加量が増えるほど分解速度が向上し、PETaseに対して低濃度であってもMHETaseの存在が総分解量を改善することが示されています。現在の実験では、PETaseとMHETaseの最適な比率は特定されていません。
Creating a super-enzyme triples PET degradation
PET分解の特性と範囲を探るさらなる実験において、研究チームはMHETaseとPETaseを1本の長い鎖につなぎ合わせた新しいスーパー酵素を設計しました。柔軟なグリシン-セリンリンカーを用いてMHETaseのC末端とPETaseのN末端を共有結合させたキメラタンパク質を作製し、非晶質PETの分解能を評価しました（図3）。異なる酵素による分解度を比較したところ、キメラタンパク質はPETase、MHETaseのいずれよりも、また連結されていない酵素混合物よりも優れた性能を示しました。
興味深いことに、このスーパー酵素はPETを解重合するだけでなく、PEF（ポリエチレンフラノエート）、すなわちビールボトルに使用される糖由来のバイオプラスチックにも作用します。
セルロースやキチンといった天然ポリマーの酵素的分解は、自然界では微生物から分泌される相乗的に作用する酵素の混合物によって達成されます8。これらの自然界の微生物システムは、時間をかけてそのようなポリマーを最適に分解するように進化してきました。I. sakaiensisのような一部の土壌細菌も同様に進化し、2つの酵素システムを利用してポリエステル基質を分解するようになったと考えられますI. sakaiensis4,9。数百年かかる自然分解とは異なり、このスーパー酵素はわずか数日でPETをモノマーに変換できますが、商業化にはまだ時間がかかりすぎます。
Endless recycling with plastic degradation
PETを元のモノマー構成単位に戻すことで、このスーパー酵素はプラスチックの製造と再利用を無限に可能にし、化石資源への依存を減らすことができます。そして、ブレイクスルーはこれだけにとどまりません。
2020年には、わずか10時間でPETを分解できる別の酵素が特定されるという大きな進歩がありました10。この研究では、2012年に初めて発見された葉枝堆肥由来のクチナーゼ（LCC）を含む、潜在的な候補となる多種多様な細菌や酵素がスクリーニングされました。その後、結合部位のアミノ酸を変化させ、熱安定性を向上させることで、数百種類の変異PET加水分解酵素が作製されました。さらに、効率的なPET分解菌を特定するために細菌変異体のスクリーニングが行われました。このプロセスを何度も繰り返した結果、天然のLCCよりも10,000倍効率的にPETを分解する変異酵素が単離されました。この酵素は72°C（PETの融点に近い温度）でも安定しています。この発見はPETの無限リサイクルの実現に大きく貢献するものであり、すでに産業パイロット段階にあります、10。
私たちが目にしているのは、これらの微生物とその酵素が提供する可能性の氷山の一角に過ぎません。ほとんどのプラスチックは化石燃料から作られており、その生成には限りがある一方で、環境中には遍在しています。循環型経済を形成する方法を見つけ出さない限り、プラスチック汚染は今後も深刻な問題であり続けるでしょう。既存の廃棄物をリサイクルする方法を見つけなければ、わずか数十年後には、私たちが依存しているプラスチック製品を製造することさえできなくなるでしょう。従来のリサイクル手法は効果的でも持続可能でもありません。プラスチックを産業規模でモノマー成分にまで還元できなければ、この問題を解決することは望めません。幸いなことに、自然の力、巧みな進化、そして科学的な創意工夫の助けを借りて、この問題が解決される希望が見えてきました。
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REFERENCES
(1) Pasbrig, E.; Claessens, P.; Walker, R. I.; Walker, R. Peelable cover film for pharmaceutical packaging, e.g. blister packs, comprises paper, aluminum foil or heat-resistant plastic, a layer of special plastic film, mesh or fabric, a layer of aluminum foil and a heat-sealing layer. EP1767347-A1; WO2007038488-A2; EP1928654-A2; AU2006294788-A1; US2008251411-A1; CN101316702-A; CA2623586-A1; JP2009509874-W; TW200727887-A; MX2008004201-A1; IN200801248-P2; ZA200802826-A; BR200616412-A2; WO2007038488-A3; EP1928654-A4.
(2) Han, X.; Liu, W. D.; Huang, J. W.; Ma, J. T.; Zheng, Y. Y.; Ko, T. P.; Xu, L. M.; Cheng, Y. S.; Chen, C. C.; Guo, R. T., Structural insight into catalytic mechanism of PET hydrolase. Nature Communications 2017, 8. DOI: 10.1038/s41467-017-02255-z
(3) Nimchua, T.; Eveleigh, D. E.; Sangwatanaroj, U.; Punnapayak, H., Screening of tropical fungi producing polyethylene terephthalate-hydrolyzing enzyme for fabric modification. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2008, 35 (8), 843-850. DOI: 10.1007/s10295-008-0356-3
(4) Yoshida, S.; Hiraga, K.; Takehana, T.; Taniguchi, I.; Yamaji, H.; Maeda, Y.; Toyohara, K.; Miyamoto, K.; Kimura, Y.; Oda, K., A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate). Science 2016, 351 (6278), 1196-1199. DOI: 10.1126/science.aad6359
(5) Rauwerdink, A.; Kazlauskas, R. J., How the Same Core Catalytic Machinery Catalyzes 17 Different Reactions: the Serine-Histidine-Aspartate Catalytic Triad of alpha/beta-Hydrolase Fold Enzymes. Acs Catalysis 2015, 5 (10), 6153-6176. DOI: 10.1021/acscatal.5b01539
(6) Austin, H. P.; Allen, M. D.; Donohoe, B. S.; Rorrer, N. A.; Kearns, F. L.; Silveira, R. L.; Pollard, B. C.; Dominick, G.; Duman, R.; El Omari, K.; Mykhaylyk, V.; Wagner, A.; Michener, W. E.; Amore, A.; Skaf, M. S.; Crowley, M. F.; Thorne, A. W.; Johnson, C. W.; Woodcock, H. L.; McGeehan, J. E.; Beckham, G. T., Characterization and engineering of a plastic-degrading aromatic polyesterase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115 (19), E4350-E4357. DOI: 10.1073/pnas.1718804115
(7) Beckham, G. T.; Johnson, C. W.; Donohoe, B. S.; Rorrer, N.; McGeehan, J. E.; Austin, H. P.; Allen, M. D. New modified polyethylene terephthalate -digesting enzyme comprising amino acid mutation of an active site residue, is used to degrade a polymer e.g. polyester, aromatic polymer or semi-aromatic polymer and polyethylene terephthalate. WO2019168811-A1.
(8) Payne, C. M.; Knott, B. C.; Mayes, H. B.; Hansson, H.; Himmel, M. E.; Sandgren, M.; Stahlberg, J.; Beckham, G. T., Fungal Cellulases. Chem. Rev. 2015, 115 (3), 1308-1448. DOI: 10.1021/cr500351c
(9) Taniguchi, I.; Yoshida, S.; Hiraga, K.; Miyamoto, K.; Kimura, Y.; Oda, K., Biodegradation of PET: Current Status and Application Aspects. Acs Catalysis 2019, 9 (5), 4089-4105. DOI: 10.1021/acscatal.8b05171
(10) Tournier, V.; Topham, C. M.; Gilles, A.; David, B.; Folgoas, C.; Moya-Leclair, E.; Kamionka, E.; Desrousseaux, M. L.; Texier, H.; Gavalda, S.; Cot, M.; Guémard, E.; Dalibey, M.; Nomme, J.; Cioci, G.; Barbe, S.; Chateau, M.; André, I.; Duquesne, S.; Marty, A., An engineered PET depolymerase to break down and recycle plastic bottles. Nature 2020, 580 (7802), 216-219. DOI: 10.1038/s41586-020-2149-4
