表现增强药物背后的科学

Zach Baum, Information Scientist, CAS
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夏季奥运会谱写了有关胜利、决心和运动伟绩的壮丽篇章。 虽然运动员总是试图在规则允许范围内获得竞争优势(从饮食到高压氧舱再到冷冻疗法),但表现增强药物 (PED) 是一条不容逾越的界限。 国际奥委会美国反兴奋剂机构世界反兴奋剂机构会不断审查、跟踪和检测表现增强药物。 虽然药物和方法不断发展,但合成代谢雄激素类固醇 (AAS) 仍然是奥运会环法自行车赛 (Tour De France)铁人三项CrossFit Games 以及其他更小众的运动中使用的主要表现增强药物。 本篇博客将详细介绍一些常见表现增强药物及其检测方法。

什么是表现增强药物?

了解类固醇、其代谢物以及睾酮的结构对于开发分析方案以检测此类成分至关重要。 睾酮 (T) 是一种天然产生的激素,也是雄激素受体的天然配体。 雄激素受体与睾酮或合成类固醇等雄激素结合后,会被激活,从而产生理想的表现增强效果,包括增强肌肉力量、骨密度和红细胞生成。 虽然更强壮的肌肉和骨骼对运动员来说是一大明显优势,但生成更多的红细胞可为肌肉和器官提供更多氧气,从而促进能量的产生和恢复。 因此,睾酮(合成睾酮和天然睾酮)是合成代谢类固醇的基础。

合成代谢类固醇主要分为三类(下图 1):

  • 睾酮衍生物
  • 5α-二氢睾酮 (DHT) 衍生物
  • 19-去甲睾酮衍生物

三类合成代谢类固醇

图 1:睾酮的结构与常见合成代谢雄激素睾酮衍生物、5α-二羟基睾酮衍生物和 19-去甲睾酮衍生物的比较。

结构、底物活性和半衰期的差异会影响这些合成代谢雄激素睾酮衍生物的生物学特征。 这些差异是设计这些化合物检测方法的基础,尤其是人体本身就有睾酮。

如何检测表现增强药物?

对于每种药物,确定其主要代谢物是开发尿液、血液或唾液直接诊断检测方法的第一步。 人体分泌的天然(内源性)睾酮 (T) 和表睾酮 (E) 的比例约为 0.4-2(图 2A)1。 最早的一种检测方法仅测量尿液样本中睾酮和表睾酮的比例。 如果 T/E 比超过 4,则可怀疑使用了外源性睾酮产品。 为了确认是否存在外源性 T,实验室可以测量 T 中 13C:12C 同位素比,因为实验室制造 T 的 13C:12C 比值略低于内源性 T2。 这种方法被用于证明 Floyd Landis 在 2006 年环法自行车赛中的表现是因为使用了外源性睾酮。

合成代谢类固醇检测的测试参数

图 2. 合成代谢雄激素类固醇检测的测试参数。 A:睾酮 (T) 和表睾酮 (E) 的结构,其在人体内以 0.4-2 的比例分泌。 T/E 值高于 4 可证明使用了 AAS。 B:通过尿液分析检测司坦唑醇所需的代谢和分析程序。

当一种甾体药物首次进入市场时,监管机构有责任了解其特性和代谢,以便对其进行检测和分析。 1988 年首尔奥运会就是这种情况,当时短跑运动员 Ben Johnson 在 100 米短跑中创造了世界纪录,但在司坦唑醇检测呈阳性后被取消了金牌。 为了开发这种药物的检测方法,研究人员必须了解司坦唑醇的代谢以及如何实现其高敏感度的检测。 图 2B 的垂直路径显示了司坦唑醇代谢的主要途径,以及通过可靠的气相色谱-质谱 (GC-MS) 法检测代谢物所需的样品处理3。 然而,司坦唑醇会产生另一种量更少的代谢物,17-表-司坦唑醇-N-葡糖苷酸 (17-epi-stanozolol-N-glucuronide),如图 2B 的水平路径所示。 该代谢物在人体内的存在时间长,服用后 28 天仍可检出! 为了通过这种代谢物检测司坦唑醇,最近开发了一种复杂的组合方法,包括电喷雾电离 (ESI) 和液相色谱-质谱 (LC-MS) 法。 简而言之,这些技术产生的离子可以通过其质量进行分离和识别,以表征和识别所存在的代谢物。


为什么表现增强药物问题屡禁不止?

当科学家们忙于改进技术以检测 2000 年代初为人所知的合成代谢雄激素类固醇时,Barry Bonds 正忙于打出本垒打。 Bonds 和其他运动员背地里一直使用一种新合成的类固醇四氢孕酮 (THG),而美国职业棒球大联盟 (MLB) 对此却知之甚少,该类药物利用了反兴奋剂检测协议的漏洞,专门用于强化合成代谢作用。 被称作“The Clear”的 THG 最初无法在尿液中检测到,因为反兴奋剂机构并不清楚其存在或代谢物。 在某一次调查中,科学家从用过的注射器上的残留物中提取并确定了 THG 样品,然后轻松开发了 LC-MS/MS 方法来进行筛查4

这起棒球界丑闻体现了有关反兴奋剂协议中直接检测 AAS 的一些问题。 首先,筛查过程是寻找已知物质的已知代谢物;因此,设备齐全的机构可以通过合成尚未被发现的“合成类固醇”来逃避检测。 即使制定了检测协议,检测不频繁(例如 MLB 每年进行两次检测)也可能导致类固醇的使用未被发现;检测之间间隔时间较长还会使得类固醇代谢物的浓度更容易降低到检测限以下。 运动员也可使用掩蔽剂和利尿剂来逃避检测5,这加重了检测机构的检测工作负担。

反兴奋剂机构意识到了这些问题,然而尽管已在努力控制这些问题,但仍有运动员铤而走险地使用表现增强药物。 早在 1990 年代,研究表明,在没有外源性药物的情况下,睾酮、其前体及其代谢物的浓度和比例在人体尿液中相当稳定,而合成代谢雄激素类固醇对这些原本稳定的激素具有持久影响。 然而,直到 2007 年,研究人员才开始采用贝叶斯推断来正式检测这些比率中的异常值。 这些比率与血液学特征一起构成了运动员生物护照 (ABP)。 该护照是一种强大的基准分析工具,可提高我们对表现增强药物的检测能力。

表现增强药物监测的未来发展趋势

体外生物活性测定是检测雄激素的另一种比较有前景的非靶向方法。 通过在雄激素响应元的调节下利用报告蛋白改变细胞,这些化验方法可以检测雄激素受体是否激活,而不管其来源如何6。 这使得生物活性测定可用于检测未知成分样品中的雄激素,例如膳食补充剂中的雄激素,近年来膳食补充剂曾导致有运动员无意中摄入违禁物质。 非靶向生物活性检测方法的进一步开发可能有助于研究人员表征新兴雄激素(无论其是天然甾体还是新兴选择性雄激素受体调节剂的一部分),其结构与睾酮并不相同,而且科学家对其代谢作用也并不了解7(图 3)。

雄激素受体调节剂

图 3. 常见滥用选择性雄激素受体调节剂 (SARM) 的化学结构。

总结

奥运会等多项赛事未来毫无疑问还会曝出个人使用兴奋剂的丑闻,有时运动员甚至还会组织的要求下使用兴奋剂。 这就是精英体育广为人知的本质。 运动员为了逃避检测而使用合成药物,但此类化合物本身并未经过临床安全性测试,因此会给运动员的健康带来风险。 但随着体育组织在药理学研究领域不断创新,反兴奋剂机构将继续利用科学获得检测表现增强药物所需的知识和分析能力。 最大限度地提升这些能力将起到威慑作用,减少兴奋剂的使用,促进实现健康体育,维护竞赛公平。


参考文献

1. Donike, M., Nachweis von exogenem Testosteron. Dt. Ärzte-Verl.: Köln, 1983; p S. 293-298.

2. Polet, M.; Van Eenoo, P., GC-C-IRMS in routine doping control practice: 3 years of drug testing data, quality control and evolution of the method. Anal Bioanal Chem 2015, 407 (15), 4397-409.

3. Schänzer, W.;  Opfermann, G.; Donike, M., Metabolism of stanozolol: identification and synthesis of urinary metabolites. J Steroid Biochem 1990, 36 (1-2), 153-74.

4. Catlin, D. H.;  Sekera, M. H.;  Ahrens, B. D.;  Starcevic, B.;  Chang, Y. C.; Hatton, C. K., Tetrahydrogestrinone: discovery, synthesis, and detection in urine. Rapid Commun Mass Spectrom 2004, 18 (12), 1245-049.

5. Alquraini, H.; Auchus, R. J., Strategies that athletes use to avoid detection of androgenic-anabolic steroid doping and sanctions. Molecular and Cellular Endocrinology 2018, 464, 28-33.

6. Lund, R. A.;  Cooper, E. R.;  Wang, H.;  Ashley, Z.;  Cawley, A. T.; Heather, A. K., Nontargeted detection of designer androgens: Underestimated role of in vitro bioassays. Drug Testing and Analysis 2021, 13 (5), 894-902.

7.Thevis, M.; Schänzer, W., Detection of SARMs in doping control analysis. Molecular and Cellular Endocrinology 2018, 464, 34-45.

 

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